微毛訶子樹皮醇提取液半數(shù)致死量的測定及對腸肌的作用

李代航，朱萬蕓，段素英，賴 泳

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

訶子為使君子科植物訶子或絨毛訶子的干燥成熟果實，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽之功效〔1〕。訶子在中國民間應用廣泛，主要含有訶子酸、沒食子酸、沒食子酸乙酯、鞣花酸及強心甾體皂苷、β- 谷甾醇等，具有抗菌作用、抗氧化作用〔2-6〕，據(jù)晶誅本草上記載，訶子對諸病均有療效。微毛訶子為訶子的變種，現(xiàn)國內外對其研究較少，且僅有的少數(shù)文獻都集中于微毛訶子的干燥成熟果實，其中龐錦江等的研究表明炙訶子對乙酰膽堿誘發(fā)的氣管平滑肌收縮有明顯的抑制作用〔7〕，但未見有關微毛訶子及其變種的樹皮醇取液半數(shù)致死量的研究及對動物腸肌作用的研究報道。本實驗觀察的是訶子的原變種微毛訶子（T.chebula Retz.var.tomentella（Kurz.）clarke.1.c.），通過先測定微毛訶子樹皮提取液對小鼠的半數(shù)致死量，然后根據(jù)微毛訶子樹皮提取液對小鼠的半數(shù)致死量制定相應濃度觀察其對動物腸肌的作用，并對微毛訶子樹皮醇取液與組胺（H）受體的關系進行了探討，為微毛訶子樹皮的臨床應用及進一步的基礎研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及試劑 微毛訶子變種的樹皮（產地：云南臨滄，由大理學院生藥教研室張德全副教授鑒定）；NaC1、95%乙醇、HCl均為市售分析純；蒸餾水（自制）；消旋山莨菪堿片（開封制藥集團有限公司，批號：20130501）；組胺（上海麗珠東風生物制藥，編號：1703）。參考文獻方法〔8〕配制臺氏液［1000 mL臺氏液含：NaCl 8.0 g、10%KCl 2.0 mL（0.2 g）、10%MgSO4·7H2O 2.6 mL（0.26 g）、5%NaH2PO4·2H2O 1.3 mL（0.065 g）、NaHCO31.0 g、1 mol/L CaCl21.8 mL（0.2 g）、葡萄糖 1.0 g］。

1.2 動物 昆明種小鼠，體重18～22 g，由大理學院動物實驗中心提供，合格證號:SCXK（滇）2010-0003。健康豚鼠由大理學院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（滇）2010-0003。

1.3 儀器 BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟電子有限公司）。

2 方法與結果

2.1 微毛訶子樹皮醇提取液及消旋山莨菪堿溶液的制備

2.1.1 微毛訶子樹皮醇提取液的制備 訶子樹皮粗粉40 g，加0.5%的鹽酸乙醇溶液140 mL于水浴中回流1 h，趁熱過濾，殘渣再用0.5%的鹽酸乙醇溶液140 mL，置于水浴中回流1 h，趁熱過濾，合并2次濾液，減壓濃縮至每1 mL相當于生藥量1 g〔9〕。

2.1.2 消旋山莨菪堿溶液的制備 按照人與小鼠藥量比1：50的比值，取規(guī)格為5 mg/片的消旋山莨菪堿配成0.025 g/kg的溶液。

2.2 半數(shù)致死量的測定 取小鼠15只，按性別分類后，根據(jù)體重隨機分成5組，每組3只；微毛訶子樹皮醇提取液分成劑量等比級數(shù)1：0.5。禁食不禁水12 h后，各組均按0.03 mL/g一次灌胃，給藥后記錄動物的及時反應并連續(xù)觀察3 d。可推測小鼠灌胃微毛訶子樹皮醇提取液為0%的劑量（Dn）為2.650 g/kg，為100%的劑量（Dm）為10.623 g/kg。根據(jù)預實驗結果，按Bliss法設計，在含Dm（10.623 g/kg）～Dn（2.650 g/kg）的劑量（含Dm和Dn）范圍內設5個劑量組（N），根據(jù)公式計算劑量比值為1.415。取小鼠150只，適應性飼養(yǎng)7 d后，均衡隨機分成5組，雌雄各半，每組30只；分別為：給藥1組（2.650 g/kg）、給藥2組（3.750 g/kg）、給藥3組（5.300 g/kg）、給藥4組（7.500 g/kg）、給藥5組（10.623 g/kg）。禁食不禁水12 h后，各組均按0.03 mL/g連續(xù)5 d灌胃，給藥后記錄動物的及時反應并連續(xù)觀察5 d。結果合并后見表1。

表1 微毛訶子樹皮醇提取液半數(shù)致死量正式試驗的實驗結果

將表1數(shù)據(jù)輸入BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)計算出LD50為5.69 g/kg，LD50的95%的可信限為4.60～7.05 g/kg。

2.3 微毛訶子樹皮醇提液對小鼠在體腸肌的影響昆明種小鼠50只，均衡隨機分為5組，每組10只，分別灌服NaCl、微毛訶子樹皮醇提液低劑量組（1.875 g/kg）、中劑量組（3.750 g/kg）、高劑量組（7.500 g/kg）劑量和消旋山莨菪堿溶液（0.025 g/kg），1次/d，連續(xù)

6 d，末次給藥前禁食不禁水12 h，給藥10 min后，各組按0.2 mL/只灌服炭末混懸液（阿拉伯膠10%，活性炭5%），20 min后脫頸椎處死小鼠，打開腹腔，分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至胃部，至于方盤內，測量小腸全長及炭末混懸液在腸內的推進距離，計算炭末推進百分率，數(shù)據(jù)用（均數(shù)±標準差）表示，采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學處理〔10〕。見表2。

表2 微毛訶子樹皮醇提取液對小鼠在體腸肌的影響（±s,n=10）

表2 微毛訶子樹皮醇提取液對小鼠在體腸肌的影響（±s,n=10）

注：與生理鹽水組比較*P＜0.05；與消旋山莨菪堿組比較#P＜0.05。

推進百分率/%73.15±12.2647.80±17.52*21.87±12.79*#46.42±16.10*50.90±21.48*組別NaCl組微毛訶子樹皮醇提液低劑量組微毛訶子樹皮醇提液中劑量組微毛訶子樹皮醇提液高劑量組消旋山莨菪堿溶液劑量/（g/kg）0.0001.8753.7507.5000.025

結果表明微毛訶子提取液低、中、高3個劑量組及消旋山莨菪堿溶液組與生理鹽水組比較有明顯的抑制小鼠腸推進作用（P＜0.05），且微毛訶子提取液中等劑量時對腸推進的抑制作用最強。微毛訶子樹皮醇提液低、中、高3個劑量組對腸推進的抑制作用均強于消旋山莨菪堿溶液組，且微毛訶子樹皮醇提液中劑量組與消旋山莨菪堿溶液組比較有明顯的抑制小鼠腸推進作用（P＜0.05）。

2.4 微毛訶子樹皮醇提液對豚鼠離體腸肌的影響

2.4.1 標本制備 取健康豚鼠，棒擊致死，剖開腹腔，迅速剪取離回盲部1 cm處回腸放入營養(yǎng)液中，洗去內容物，剪除腸管周圍的脂肪和結締組織后剪成1.0～1.5 cm左右待用。

2.4.2 實驗前準備 打開HW-400恒溫平滑肌浴槽，使浴槽內溫度保持為（37±0.5）℃。打開BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)，調零，定標，增益調節(jié)G=50，時間常數(shù)T=DC，濾波調節(jié)F=30 Hz，掃描速度S=8.00/div。取標本，兩端對角穿線，下端系于L型鉤上固定，上端連接拉力換能器后將其放在盛有20 mL臺試液的恒溫浴管中，通入混合氣60～80個氣泡/min。標本負荷2 g，平衡30 min，待試驗系統(tǒng)穩(wěn)定后，開始實驗〔11-12〕。

2.4.3 微毛訶子樹皮醇提液對離體腸肌的影響

等收縮波形穩(wěn)定后，先描記15 min正常的腸平滑肌收縮曲線，再逐次向浴槽中加入微毛訶子樹皮醇提液0.1 mL，等到腸張力基本無變化后，記錄5 min腸平滑肌收縮曲線，重復實驗。每種藥物完成后，立即用新鮮臺氏液沖洗3次，待腸段管舒縮恢復正常后才可進行下一次給藥，無法恢復正常舒縮的腸段棄去。見表3。

表3 微毛訶子醇提液對豚鼠離體腸肌的影響（± s,n=10）

表3 微毛訶子醇提液對豚鼠離體腸肌的影響（± s,n=10）

注：每組分別與給藥后比較*P＞0.05，每組分別與給藥后比較#P＜0.05。

1.718±0.377*1.616±0.277#1.519±0.320#微毛訶子樹皮醇提液1組微毛訶子樹皮醇提液2組微毛訶子樹皮醇提液3組0.250.501.001.992±0.3601.982±0.3281.938±0.260

由表3可知，當微毛訶子樹皮醇提液的濃度為0.25 g/mL時，微毛訶子醇提液對豚鼠離體腸肌具有一定的抑制作用，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而當微毛訶子樹皮醇提液的濃度為0.5 g/mL、1 g/mL時，微毛訶子醇提液對豚鼠離體腸肌的抑制作用明顯，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果表明微毛訶子樹皮醇提液對離體腸肌的蠕動具有抑制作用，且隨著濃度的增加，微毛訶子樹皮醇提液對離體腸肌的抑制作用加強。

2.5 微毛訶子樹皮醇提液作用機制的探究 待腸肌收縮穩(wěn)定后，記錄一次腸肌的正常運動曲線；然后加入0.4 mL的1 g/mL的微毛訶子樹皮醇提液，記錄一次腸肌的張力變化曲線；換液，然后加入0.3 mL的0.1 g/L的組胺，記錄一次腸肌的張力變化曲線；換液，待腸肌收縮穩(wěn)定后，先加入0.4 mL的1 g/mL的微毛訶子樹皮醇提液，待波峰降至最低點時，立即加入0.3 mL的0.1 g/L的組胺，重復實驗。每種藥物完成后，立即用新鮮臺氏液沖洗3次，待腸段管舒縮恢復正常后才可進行下一次給藥，無法恢復正常舒縮的腸段棄去〔13〕。見表4及圖1。

表4 微毛訶子醇提液對組胺誘導豚鼠離體腸肌收縮的影響（±s,n=10）

表4 微毛訶子醇提液對組胺誘導豚鼠離體腸肌收縮的影響（±s,n=10）

注：與正常組比較*P＜0.05，與微毛訶子醇提液+組胺比較#P＜0.05。

1.904±0.05421.333±0.4593.048±0.117*#2.032±0.280正常微毛訶子樹皮醇提液組胺微毛訶子樹皮醇提液+組胺—1 g/mL 0.1 g/L 1 g/mL+0.1 g/L

圖1微毛訶子醇提液加組胺后對豚鼠離體腸肌的影響

由表4可知，當向正常蠕動的腸肌加入組胺后，腸肌收縮且與正常組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；先加入微毛訶子后立刻加入組胺時腸肌收縮，與只加入組胺組相比收縮程度降低（P＜0.05），說明組胺對微毛訶子樹皮提取液對腸肌的抑制作用具有一定的拮抗作用。

3 討論

隨著社會的發(fā)展，中藥的無創(chuàng)傷性治療和整體性的治療觀念越來越受人們的重視，然而中藥的安全性問題一直阻礙了中藥的發(fā)展。本次實驗對中藥微毛訶子樹皮醇提液的毒性進行了研究，根據(jù)LD50＜ 5 g/kg為大毒，5～16 g/kg為有毒，16～50 g/kg為小毒，＞50 g/kg為無毒的標準依據(jù)〔14〕，本次實驗的毛訶子的LD50為5.69 g/kg，可見毛訶子樹皮的醇提液具有一定的毒性；另外，我們還對微毛訶子的樹皮醇提液進行了小鼠的在體和離體研究，研究的結果均表明微毛訶子樹皮的醇提液對腸肌的收縮具有一定的抑制作用，這說明微毛訶子的樹皮在緩解由于腸肌緊張引起的腹痛等方面具有潛在的應用價值。

微毛訶子樹皮的醇提液中具有許多的化合物，微毛訶子樹皮的醇提液對腸肌的收縮具有一定的抑制作用，然而微毛訶子樹皮的醇提取液具有一定的毒性，說明在微毛訶子樹皮的醇提液的化合物中，有些成分是有毒的，有些成分是對腸肌緊張引起的腹痛等方面的疾病具有一定治療作用的，希望以后研究者能利用現(xiàn)在的天然藥物化學的技術和方法，對微毛訶子樹皮中的成分進行提取，以期發(fā)現(xiàn)無毒且具有活性的物質應用于臨床。

在實驗的最后，我們就微毛訶子樹皮是否作用于H受體進行了機制探討，結果我們發(fā)現(xiàn)組胺對微毛訶子提取液對腸肌的抑制作用具有拮抗作用，這說明微毛訶子的作用位點可能與H受體有關，但具體是與H1或H2或兩者均有關這就還需要更多的實驗來驗證，并且微毛訶子除了與H受體外，與其它受體是否有關這還有待科研工作者們進行進一步的研究和探討。

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