二十二碳六烯酸對白介素1β誘導的動脈平滑肌細胞增殖和遷移的影響及機制探究

拓步雄 李超民 葉明霞 劉 薇 李 慧

解放軍第四五一醫院心血管內科，陜西西安710054

二十二碳六烯酸對白介素1β誘導的動脈平滑肌細胞增殖和遷移的影響及機制探究

拓步雄 李超民 葉明霞 劉 薇 李 慧▲

解放軍第四五一醫院心血管內科，陜西西安710054

目的探討二十二碳六烯酸（DHA）對白介素1β（IL-1β）誘導的動脈平滑肌細胞增殖和遷移的影響及機制。方法血管平滑肌細胞（VSMCs）培養及傳代后，分為對照組、IL-1β組、DHA組、IL-1β和DHA處理組四組，其中對照組細胞加入50μL磷酸鹽緩沖液（PBS）；IL-1β組細胞加入10 ng/mL IL-1β；DHA組細胞加入80μmol/L DHA；IL-1β和DHA處理組加入10 ng/mL IL-1β和80μmol/L DHA，培養48 h后，噻唑藍（MTT）法和Transwell法檢測VSMCs的增殖和遷移情況；qRT-PCR和Western blotting技術檢測基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1、TIMP-2和Notch3的表達情況。結果VSMCs的增殖率和遷移能力經IL-1β處理后顯著增高，而IL-1β和DHA處理組顯著低于IL-1β處理組（F=25.537，P=0.003）；MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達量經IL-1β處理后顯著增高，而經IL-1β和DHA共處理后顯著低于IL-1β組（MMP-2：F= 34.286，P=0.000；TIMP-2：F=21.034，P=0.009；MMP-9：F=31.732，P=0.000；TIMP-1：F=18.213，P=0.021）；IL-1β組細胞Notch3表達量顯著降低，IL-1β和DHA處理組中Notch3的表達水平則顯著高于IL-1β處理組（F=39.235，P= 0.000）。結論DHA可通過Notch信號通路抑制VSMCs的增殖和遷移。

二十二碳六烯酸；白介素1β；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9；組織金屬蛋白酶抑制劑-1；組織金屬蛋白酶抑制劑-2；Notch3

血管壁結構的改變是高血壓病理改變的普遍特征。目前普遍認為，高血壓基本病理改變是血管重塑。動脈壁中膜肥厚是高血壓血管壁增厚的主要原因，這與血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和遷移密切相關。研究表明多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）可降低心血管疾病的發病率和病死率[1]。DHA除了具有很好的降血脂作用外，還可以通過影響內皮細胞和VSMCs的生物學行為進而調節血壓。在炎性反應中DHA可降低VSMCs的增殖和遷移[2-3]。研究表明，在高血壓、血管再狹窄和動脈粥樣硬化過程中VSMCs的增殖和遷移與基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）降解細胞外基質密切相關[4]。當血管損傷后炎癥因子高表達，上調MMP-2和MMP-9，使細胞外基質大量降解，加速了VSMCs向血管內膜遷移，導致血管壁增厚，引起血壓上升，血栓形成[5-6]。目前，有關DHA的降血壓機制的研究尚不多見。本文通過研究DHA對VSMCs增殖及遷移的影響，以及對基質金屬蛋白酶及其抑制劑含量的變化探討了DHA對高血壓的影響及機制。

表1 引物列表

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠，山東綠葉制藥有限公司動物實驗中心提供，合格證號：20030020；干粉培養基（DMEM），美國Gibco公司生產；Trizol，加拿大Invitrogen公司提供；Quantscript RT kit，總RNA提取試劑盒購自于Takara公司；瓊脂糖購自于BioWest公司；RIPA裂解液，購自于美國Millipore公司；DHA、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰蛋白酶購自于Sigma公司；水套式二氧化碳孵箱，美國Nuaire公司生產；超凈工作臺，蘇州凈化設備公司生產；PCR儀：MJResearch INC生產。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養8周齡的雄性大鼠，頸椎脫臼處死，取胸主動脈，放入磷酸鹽緩沖液（PBS）中清洗。剝去動脈外膜及內膜，取血管的中層組織洗凈后剪成1mm2大小的組織塊，按組織貼塊法接種于200mL/L胎牛血清的DMEM培養液中，于5%CO2、37℃下培養24 h。待細胞達到80%的融合后，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實驗分組處理消化細胞并收集細胞懸液，將細胞以1×105/孔接種于24孔細胞培養板中，然后將細胞隨機分為四組：對照組細胞加入50μLPBS培養48 h； IL-1β組細胞加入10 ng/mL IL-1β共培養48 h；DHA組細胞加入80μmol/L DHA培養48 h；IL-1β和DHA處理組細胞加入10 ng/mL IL-1β和80μmol/L DHA培養48 h。

1.2.3MTT檢測細胞增殖細胞增殖采用MTT法進行檢測。細胞消化后通過計數板計數，將細胞以1×104/孔的密度接種至96孔培養板中。接種12 h后，按上述分組方法進行培養。每組做6個重復。培養48 h后每孔加入5 g/L的MTT 20μL，37℃恒溫箱中培養4 h，去上清，每孔加入200μL DMSO，振搖20 min，用紫外分光光度計測定570 nm下的光密度值（OD）。

1.2.4 Transwe l l法檢測細胞侵襲在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜（膜孔徑8μm）上涂1 g/L的matrigel 70μL，37℃，60 min使之在微孔濾膜上重組為基底膜結構。取對數生長期的VSMCs，以DMEM培養液[不加胎牛血清（FBS）]，調整細胞懸液中細胞數為l×105/mL，取200μL細胞懸液接種于Transwell上室內，下室加入10%FBS的DMEM培養液500μL，37℃，5%CO2培養24 h后，將濾膜上層細胞用棉簽抹去，濾膜以甲醇固定，然后用結晶紫染色15min。100倍光鏡下選擇膜上、下、左、右、中5個不同視野的穿過膜細胞數，求平均值。

1.2.5 qRT-PCR檢測VSMCs細胞分組處理48 h后，利用PBS清洗細胞3遍，然后胰酶消化收集細胞，依據試劑盒說明，采用Trizol（Invitrogen，CA）抽提法提取總RNA，提取出的RNA用紫外分光光度計測OD值，以確定RNA的濃度和純度；采用Quantscript RT kit反轉錄合成cDNA，PCR擴增。PCR擴增條件：94℃，1.5min；94℃，1 min；64℃，1 min；72℃，1 min 40個循環，最后在72℃下延伸10 min，同樣的方法擴增內參基因三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。引物信息見表1。

1.2.6 Wes te rn b l ot t ing檢測蛋白表達細胞分組處理48 h后，利用PBS清洗細胞3遍，然后胰酶消化收集細胞，用RIPA細胞蛋白裂解液提取細胞中的蛋白，二辛可酸（BCA）法測定蛋白濃度。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳，上樣量為40μg/行，電泳完畢后，電轉移至PVDF膜進行如下處理：牛血清白蛋白（BSA）封閉過夜，一抗（1∶1000比例稀釋）室溫撫育2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌3次，辣根過氧化物酶（HRP）-IgG（1∶100比例稀釋）室溫撫育2 h，PBST洗滌3次，電化學發光（ECL）顯色，暗室曝光。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VSMCs的增殖情況

MTT法檢測VSMCs的增殖情況，結果顯示，DHA組VSMCs的相對增殖率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而IL-1β組VSMCs的相對增殖率顯著增高（P＜0.05）；IL-1β和DHA共處理組VSMCs的相對增殖率與IL-1β組VSMCs的相對增殖率相比顯著下降（P＜0.01）。見圖1。

圖1 不同處理組血管平滑肌細胞的相對增殖率

2.2 VSMCs的遷移情況

Transwell法檢測VSMCs的遷移，結果顯示，DHA組VSMCs的穿膜均數為（18.24±5.31）個，與對照組[（22.17±4.58）個]比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；IL-1β組VSMCs的穿膜均數高達（64.72±21.35）個，顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；當經IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養時，VSMCs的穿膜數量為（38.94±8.45）個，顯著低于IL-1β組VSMCs的穿膜數量，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9和TIMP-1的表達

Western blotting檢測MMP-2、TIMP-2、MMP-9及TIMP-1在VSMCs中的表達，結果顯示，與對照組比較，DHA組VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值改變不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05）；而IL-1β組的VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。當經IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養48 h后，細胞中的MMP-2、MMP-9的表達量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值與IL-1β組相比有顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 不同處理組血管平滑肌細胞中MMP-2和TIMP-2的表達

2.4 Notch信號通路關鍵調控因子Notch3在VSMCs中的表達

DHA組VSMCs中Notch3的表達量與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Notch3在IL-1β組VSMCs中的表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；當經IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養48 h后，VSMCs中的Notch3表達量與IL-1β組相比顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05），提示DHA對VSMCs增殖和遷移的抑制作用是通過Notch信號通路實現的。見圖4。

3 討論

圖3 不同處理組血管平滑肌細胞中MMP-9和TIMP-1的表達

VSMCs是構成血管壁的重要組成成分，其增殖過度是導致多種心血管疾病，尤其是高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等的關鍵環節[7-8]。正常成熟的血管中VSMCs處于分化狀態，當局部血管在炎癥因子等刺激作用下損傷后，局部釋放大量細胞因子和生長因子，使位于中膜的VSMCs表型發生改變，導致細胞收縮功能消失，并由中膜向內膜遷移、增殖，同時分泌大量的細胞外基質（extra-cellularmatrix，ECM）。本實驗用炎癥因子IL-1β對VSMCs進行了處理，誘導VSMCs細胞發生炎性反應，引起其大量增殖，然后用DHA進行處理，比較不同處理組VSMCs中MMP-2和MMP-9及其抑制劑的表達差異，并對Notch信號途徑中的主要調控因子Notch3進行了檢測，探討DHA對VSMCs增殖和遷移的影響及機制。

MMPs是一類可降解ECM的鋅蛋白酶家族，以酶原的形式分泌，由其他蛋白酶或炎癥因子激活，在組織重構及ECM的動態平衡中發揮著重要作用[9]。TIMPs是MMPs的主要抑制劑，主要由肌成纖維細胞、VSMCs、激活的星形膠質細胞等分泌，其分泌為基本的生理所需，隨MMPs的表達而表達，二者維持在一定的比例，調節ECM的動態平衡，若二者的比例失衡，將引起多種病理反應。本研究發現經IL-1β誘導的VSMCs的增殖及遷移能力顯著增高，且MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表達量顯著上調，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值均顯著增高，比例失調。與DHA共培養后VSMCs的增殖及遷移能力顯著下降，MMP-2和MMP-9的表達量及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值都表現為顯著下調。說明VSMCs的增殖及遷移與MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例失衡具有相關性，DHA可以降低MMP-2和MMP-9的表達量，從而降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值，對抑制VSMCs的增殖及遷移發揮重要的作用。

圖4 不同處理組血管平滑肌細胞中Notch3的表達

Notch信號通路一條最初發現于果蠅、高度保守的信號轉導途徑，廣泛存在于各種生物體內。Armulik等[10]的研究發現Notch信號通路在調節VSMCs形態和功能中發揮重要作用。本研究發現：經IL-1β處理的VSMCs中低表達Notch3；經IL-1β處理的VSMCs與DHA共培養后Notch3的表達量表現為顯著增高，VSMCs的增殖和遷移能力也顯著降低，說明Notch3在DHA抑制平滑肌細胞增殖和遷移中發揮重要作用。

DHA對VSMCs生理功能的調節作用已被多個研究所報道[11-12]。有研究認為ω-3不飽和脂肪酸特別是DHA一方面極易與膜磷脂或三酰甘油相融合并增加VSMCs膜固醇類的流動從而對與胞膜密切相關的信號分子產生影響[13]，而另一方面對細胞膜離子通道進行調控，最終調節細胞內的信號轉導[14]。

綜上所述，本研究發現DHA可以降低炎性反應所引起的VSMCs中MMP-2和MMP-9的高表達，調節MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例，抑制VSMCs的增殖和遷移，在高血壓的病理過程中發揮重要作用。同時，本研究發現DHA發揮調節作用的過程中Notch3起到了關鍵性的作用，此結果提示DHA作用的發揮可能是通過Notch信號通路實現的。

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Effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid for vascular smooth muscle cells proliferation and m igration induced by IL-1β

TUO Buxiong LIChaomin YEMingxia LIUWei LIHui▲
Department of Cardiology,the 451st Hospital of PLA,Shaanxi Province,Xi′an 710054,China

Objective To study the effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid(DHA)for vascular smooth muscle cells(VSMC)proliferation and migration induced by interleukin(IL-1β).Methods Subcultured VSMCswere divided into four groups:control group,DHA group,IL-1βgroup and IL-1βcombined with DHA group.Cells were cocultured with 50μL PBS in control group,with 10 ng/mL IL-1βin IL-1βgroup,with 80μmol/L DHA in DHA group,with 10 ng/mL IL-1βand 80μmol/L DHA in IL-1βcombined with DHA group for 48 h.MTT and Transwell methodswere used to detect VSMCs proliferation andmigration.qRT-PCR and Western blottingmethodswere used to measure the expression ofmatrixmetalloproteinase(MMP)-2,MMP-9,tissue inhibitor ofmetalloproteinase(TIMP)-1, TIMP-2 and Notch3.Results The proliferation and migration of VSMCs significantly increased in IL-1βgroup,while the proliferation andmigration ability of VSMCs significantly decreased compared with IL-1βgroup(F=25.537,P=0.003). In IL-1βgroup,the expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 significantly increased(P＜0.05),whereas the expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 in IL-1βcombined with DHA group significantly decreased compared with IL-1βgroup(MMP-2:F=34.286,P=0.000;TIMP-2:F=21.034,P=0.009;MMP-9:F=31.732,P=0.000; TIMP-1:F=18.213,P=0.021).The expression of Notch3 in IL-1βgroup was significantly lower,while in the IL-1β combined with DHA group the expression of Notch3 was significantly higher than that in the IL-1βgroup(F=39.235, P=0.000).Conclusion DHA can inhibit VSMCs proliferation and migration through the Notch signaling pathway.

Docosahexaenoic Acid;IL-1β;MMP-2;MMP-9;TIMP-1;TIMP-2;Notch3

R544.1

A

1673-7210（2014）09（c）-0021-05

2014-05-25本文編輯：衛軻）

▲通訊作者