雙環醇對腎間質纖維化大鼠的干預作用

孟曉華 董科 徐湜潺 馮曉明 田曉 史國輝

河北聯合大學附屬醫院腎內科，河北唐山063000

雙環醇對腎間質纖維化大鼠的干預作用

孟曉華 董科 徐湜潺 馮曉明 田曉 史國輝

河北聯合大學附屬醫院腎內科，河北唐山063000

目的觀察單側輸尿管梗阻（UUO）模型大鼠在雙環醇的干預下，肝細胞生長因子（HGF）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達的動態變化，探討雙環醇延緩腎間質纖維化的可能機制。方法將60只雄性SD大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組、雙環醇組，每組各20只，建立單側輸尿管梗阻模型。雙環醇組于術前2 d給予雙環醇[200 mg/（kg·d）]灌胃，假手術組、模型組給予等量自來水灌胃。每組分別在術后3、6、9、14 d時隨機處死5只大鼠并取左側腎組織，行HE染色觀察腎組織病理變化，免疫組織化學染色觀察HGF、TGF-β1蛋白的表達，RT-PCR法檢測腎組織HGF mRNA的表達水平。結果模型組中HGF蛋白及mRNA表達均呈現早期升高后期降低的趨勢，在第6天表達量最高，隨后逐漸下降，表達量在術后3、9、14 d與術后6 d比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）。而TGF-β1蛋白的表達量呈現隨梗阻時間延長逐漸升高趨勢，術后3、6、9 d與術后14 d比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在相同時間點，雙環醇組與模型組相比，HGF蛋白及mRNA表達量顯著升高，差異有高度統計學意義（P＜0.01），而TGF-β1蛋白表達量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論雙環醇通過上調HGF及下調TGF-β1的表達而發揮緩解腎間質纖維化的作用。

肝細胞生長因子；雙環醇；腎間質纖維化；轉化生長因子-β1

無論腎小球疾病還是腎間質病變，其終極歸宿均為間質纖維化，終將進展為慢性腎功能衰竭，患者需終生依賴腎臟替代治療。尋找可能延緩、改善腎間質纖維化的藥物是當今研究的熱點。雙環醇是目前應用在肝炎領域的國家Ⅰ類新藥，已有研究表明，雙環醇可以抑制肝纖維化的發生、發展[1-2]。因為腎間質纖維化同肝纖維化的發生機制基本相同，所以本研究應用雙環醇干預單側輸尿管梗阻（UUO）大鼠，動態觀察其對肝細胞生長因子（HGF）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達的影響，研究雙環醇是否對腎間質纖維化同樣具有抑制作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性SD大鼠60只（由河北聯合大學實驗動物中心提供），體重180～220 g。雙環醇由北京協和藥廠生產（生產批號111122）；Trizol試劑Invitrogen公司生產，購自華美生物工程公司；AMV Reverse Transcriptase、4×dNTP、Rasine、Radom primer均為Promega公司生產，購自華美生物工程公司；Taq DNA聚合酶購自北京賽百盛生物工程公司；引物由上海生物工程有限公司合成，HGF引物1：5′-GAGCCAGACGCTAGCAAGTT-3′，引物2：5′-AATCTGAGCCTTCAGGTCCAT-3′；β-actin引物1：5′-GCCATGTACGTAAGCCATCCA-3′，引物2：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′；兔抗大鼠HGF多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、SP系列試劑盒購自Boster公司；瓊脂糖、Marker 100 bp購自鼎國生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、UUO模型的建立及標本收集將60只大鼠隨機分為3組（每組各20只）：假手術組、模型組、雙環醇組。將大鼠用2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，取下腹部正中切口，經腹腔在左后腹壁分離沿腎門下行的左輸尿管，在其上1/3處結扎并切斷，使左腎完全梗阻。假手術組僅游離左側輸尿管，但不結扎和剪斷。雙環醇組于術前2 d給予雙環醇200 mg/（kg·d）[3]灌胃，假手術組、模型組給予等量自來水灌胃。各組分別在術后3、6、9、14 d隨機處死5只大鼠，迅速切取左腎，一部分立即置于液氮中冷凍保存，用于提取組織RNA，剩余部分用10%福爾馬林固定用于HE染色及免疫組織化學染色。

1.2.2 常規病理學檢查（HE染色）HE染色后在真彩醫學圖像系統下計算腎間質病變相對面積。每張切片在高倍鏡（200×）下分別選取10個不重疊視野，計算視窗內腎間質病變面積占1個視野的面積百分比，取平均值。再由2名觀察者進行獨立雙盲觀察切片中腎小管間質的病變程度。根據Banff分級[4]對病變程度進行評定。

1.2.3 免疫組織化學染色采用SP法免疫組化染色檢測腎組織HGF、TGF-β1的表達，操作步驟按照說明書進行。光鏡下陽性反應部位呈棕黃色。通過光學顯微鏡攝入圖像，放大400倍，隨機選取20個互不重疊視野，由2名觀察者進行獨立雙盲觀察。以陽性細胞的百分率及陽性細胞染色強度的乘積進行評分。染色強度以多數細胞呈現的染色特性（染色深淺需與背景著色相對比）計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分率：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分[5]。

1.2.4 反轉錄PCR（RT-PCR）Trizol法提取各組腎組織總RNA，行純度、含量、完整性的鑒定后逆轉錄擴增cDNA。以cDNA為模板，根據Genebank提供的上下游引物，PCR擴增mRNA。擴增條件：94℃5 min；94℃45 s、48℃30 s、72℃30 s，32個循環；72℃5 min，4℃保存。PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外光下采集圖像進行分析。HGF的相對表達量為特定性擴增產物HGF電泳帶與β-actin電泳帶峰面積積分值之比。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎小管間質的病理改變

HE染色光鏡切片示：假手術組各時期腎小球腎小管間質結構未見異常。模型組術后3 d可見腎小管稍有擴張，腎間質明顯水腫，少量炎性細胞浸潤。隨著梗阻時間延長，腎小管管腔明顯擴張，腎小管上皮細胞逐漸壞死、脫落，間質中大量炎性細胞浸潤。術后14 d腎小管結構嚴重毀損，管腔塌陷，大量腎小管上皮細胞死亡。模型組各時間點之間病變面積差異有高度統計學意義（P＜0.01）。相同時間點下，雙環醇組病變面積顯著低于模型組（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 各組大鼠腎間質病變范圍（%，x±s）

圖1 術后14 d三組大鼠腎組織HE染色（200×）

2.2 免疫組化染色結果

2.2.1 HGF染色假手術組中HGF僅在腎小管上皮細胞及小管周圍細胞有微量表達，各時間點間差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組HGF的表達位置與假手術組基本一致，表達量呈現早期升高、后期降低的趨勢，術后3、9、14 d與術后6 d相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在相同時間點，雙環醇組與模型組相比，表達量有顯著升高（P＜0.01）。見表2、圖2（封三）。

表2 各組大鼠腎組織HGF蛋白表達比較水平（分，x±s）

2.2.2 TGF-β1染色TGF-β1在假手術組中無或僅在腎間質中有微量表達。模型組術后3 d在腎小管間質輕度表達，表達量隨時間延長而逐漸增強；模型組術后3、6、9 d與術后14 d相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在相同時間點，雙環醇組與模型組相比，表達量有顯著下降（P＜0.01）。見表3、圖3（封三）。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達水平比較（分，x±s）

2.3 反轉錄PCR結果

HGF mRNA在各組中的表達情況：假手術組中有少量表達，各時間點之間差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組表達量呈現早期升高后期降低的趨勢，在第6天表達量最高，隨后逐漸下降，表達量在術后3、9、14 d與術后6 d相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。在相同的時間點，雙環醇組與模型組相比，表達量有顯著升高（P＜0.01）。見表4、圖4。

表4 各組大鼠腎組織HGF mRNA表達水平比較（x±s）

圖4 各組大鼠腎組織不同時間點HGF mRNA表達

3 討論

大量的臨床實踐和實驗表明，腎間質纖維化輕重程度是決定腎臟預后的重要因素[6-8]。因此，防止、減緩、最終逆轉腎間質纖維化的發生和發展，是一個全球性的難題。許多因子及活性物質，均參與了腎臟損傷與修復過程的調控。其中TGF-β是腎纖維化最關鍵的細胞因子，TGF-β1表達上調幾乎是所有慢性腎臟疾病的共同特征[9-10]。TGF-β1在腎間質纖維化中的作用主要表現為：①促進細胞外基質成分堆積[11]；②誘導腎間質成纖維細胞增殖，并活化為肌成纖維細胞[12]；③促進腎小管上皮細胞凋亡[13]；④誘導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化[14]。致纖維化因子表達增強的同時，抗纖維化因子的丟失可能是腎組織損傷后纖維化的重要因素。HGF具有強效抗纖維化作用。HGF和TGF-β1之間存在相互制約、相互拮抗的作用，二者之間的比例決定了組織受損時是得到修復還是纖維化[5]。HGF能抑制腎間質纖維化發生和發展過程中的多個病理過程，主要表現為：①通過活化P13K/Akt途徑以及增加Bcl-xL表達的雙重機制，防止腎小管上皮細胞凋亡[15]；②抑制靜息狀態下腎間質成纖維細胞的活化[16]，防止腎小球系膜細胞激活[17]，阻斷腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化[18]；③拮抗腎臟炎性反應的發生和進展[19]；④促進細胞外基質的降解[20]。雙環醇是一種抗肝炎新藥，已有研究發現，雙環醇對不同類型的肝纖維化動物模型及臨床患者的肝纖維化具有明顯的抑制作用。新鄉醫學院第一附屬醫院研究發現，雙環醇可下調UUO大鼠腎間質中核轉錄因子-κB（NF-κB）[3、21]、細胞間黏附因子-1（ICAM-1）[21]、結締組織生長因子（CTGF）[22]、基質金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP-1）[23]、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）[23]的表達，從而延緩間質纖維化的進程，對腎臟發揮保護作用。

目前應用最廣的研究腎小管間質纖維化的動物模型是由單側輸尿管結扎建立的UUO動物模型[24]。本試驗觀察到，在相同時間點，雙環醇組與模型組相比病變面積顯著降低（P＜0.01）。模型組中HGF蛋白及mRNA的表達均呈現早期升高后期降低的趨勢，在術后第6天表達量最高，隨后逐漸下降（P＜0.01）。而TGF-β1蛋白的表達量呈現隨梗阻時間延長逐漸升高趨勢（P＜0.01）。在相同時間點，雙環醇組與模型組相比，HGF蛋白及mRNA的表達量顯著升高（P＜0.01），而TGF-β1蛋白表達量有顯著降低（P＜0.01）。

綜上所述，雙環醇可以緩解UUO大鼠的腎間質纖維化，其可能機制是通過上調HGF及下調TGF-β1的表達而發揮腎臟保護作用。

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Intervention effect of bicyclol for rats with renal interstitial fibrosis

MENG XiaohuaDONG KeXU ShichanFENG XiaomingTIAN XiaoSHI Guohui
Department of Nephrology,Affiliated Hospital of Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063000,China

Objective To observe the dynamic change of hepatocyte HGF and TGF-β1of UUO rats intervened by bicyclol,in order to discuss the possible mechanism of renal interstitial fibrosis delayed by bicyclol.Methods 60 male SD rats were randomly divided into sham-operated group(SOR),UUO model group and bicyclol-treated group(BIC),each group had 20 rats.Through ligating the left ureter,the unilateral ureteral obstructive rat model was established.2 days before surgery,the rats in bicyclol-treated group were administed with bicyclol[200 mg/(kg·d)].Rats in the sham-operated group and the model group were administed with tap water.Rats were sacrificed after the surgery for 3,6,9 and 14 days.The left kidney was taken.RT-PCR was used to detect the expression of HGF mRNA in renal tissue.The expression of HGF and TGF-β1protein were measured by immunohistochemistry.HE stain was used to examine the area of pathological changes.Results In model group,the mRNA and protein expression levels of HGF increased markedly on day 3 and reached its peak value on day 6 after the surgery,then slowly fallen down,and the expression levels on day 6 were significantly different between on day 3,9,14 after the surgery,the differences were statistically significant (P＜0.01).However,the protein expression levels of TGF-β1increased with extension of obstruction,and the expression levels on day 14 were significantly different from on day 3,6,9 after the surgery,the differences were statistically significant(P＜0.01).At each research point,the mRNA and protein expression levels of HGF were significantly higher in the bicyclol-treated group than those in the model group,the differences were statistically significant(P＜0.01). The protein expression level of TGF-β1was significantly lower in the bicyclol-treated group than that in the model group,the difference was statistically significant(P＜0.01).Conclusion Bicyclol can alleviate the degree of renal interstitial fibrosis through increasing the expression of HGF and decreasing the expression of TGF-β1.

Hepatocyte growth factor;Bicyclol;Renal interstitial fibrosis;TGF-β1

R692.2

A

1673-7210（2014）10（b）-0015-05

2014-07-03本文編輯：程銘）

河北省唐山市科技計劃項目（編號12140209A43）。