苯酚降解菌的分離及其降解特性研究

顏家保，余永登

(武漢科技大學化學工程與技術學院，湖北 武漢，430081)

苯酚及其衍生物是一種常見的有毒有機污染物，且具有致癌性。含苯酚的工業廢水在直接排放到水體前必須經過適當處理，否則會對生態系統造成不可估量的破壞[1-2]。微生物降解方法在苯酚污染治理中起著重要作用，為了強化生物處理效果，可以向生化反應池中投加人工篩選出的高效菌，提高目標污染物的去除率[3]。目前，運用生物降解法降解苯酚的研究文獻較多，研究人員從污染土壤、污水等環境中分離得到各種各樣的苯酚降解菌[4-9]。筆者從某焦化廠活性污泥中馴化分離得到一株苯酚降解菌，通過革蘭氏染色和一系列生理生化特征實驗對該菌株進行初步鑒定，考察多項生長降解條件對其苯酚降解特性的影響，并研究該菌株的苯酚降解動力學方程，以期為工業化處理酚類廢水提供參考。

1 實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

菌種取自武漢鋼鐵集團公司某焦化廠曝氣池活性污泥。

1.1.2 培養基

(1)液體LB培養基：10 g蛋白胨，5 g酵母浸粉，10 g NaCl，加蒸餾水定容至1000 mL。

(2)微量元素溶液：0.1 g FeSO4，0.1 g ZnSO4，0.01 g KAl(SO4)2，0.01 g NaMo2O4， 0.1 g CoCl2，0.01 g CuSO4，0.01 g H3BO3，加蒸餾水定容至1000 mL。

(3)苯酚無機鹽培養基：1.0 g NaCl，0.1 gCaCl2， 0.5gKH2PO4，0.5gMgSO4·7H2O，0.5 g K2HPO4，1.0 g NH4NO3，2 mL微量元素溶液，加蒸餾水定容至1000 mL，pH值為7.0～7.2。

(4)選擇性固體培養基：在苯酚無機鹽培養基中按20 g/L加入瓊脂，再分別加入一定濃度的苯酚。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯酚降解菌的富集、分離和純化

在盛有100 mL LB培養基的錐形瓶中接種污泥樣本，將培養基在150 r/min、30 ℃的恒溫搖床上培養24 h，取3 mL培養液轉接到100 mL苯酚無機鹽培養基中，向其中加入濃度為500 mg/L的苯酚，在相同條件下培養1～2 d，再從中取3 mL培養液接至新鮮苯酚無機鹽液體培養基中，使苯酚濃度為600 mg/L，在相同條件下培養2～3 d，以梯度濃度方式馴化篩選菌株(苯酚濃度逐步由500 mg/L上升至1200 mg/L)。最后將苯酚濃度為1200 mg/L的培養液稀釋，按照涂布平板法在苯酚無機鹽平板上涂布，并在30 ℃恒溫箱中培養1～2 d，挑選清晰的菌落，經2～3次平板劃線直至獲得單一菌落，分別考察苯酚在各單一菌落下的降解率，選取其中一株效果最優的菌株于4 ℃保存備用。

1.2.2 菌株鑒定

通過光學顯微鏡觀察菌體形態，并通過革蘭氏染色和一系列生理生化特征實驗對經分離純化得到的菌株進行初步鑒定。

1.2.3 苯酚降解實驗

將菌株加入盛有100 mL無機鹽培養基的錐形瓶中，在恒溫搖床中進行苯酚降解實驗。改變菌株接種量、培養基初始pH值、培養溫度、搖床轉速、金屬離子種類等降解條件，考察苯酚降解效果。

1.2.4 苯酚濃度的測定和菌株生長曲線的繪制

按照《水質 揮發酚的測定 4-氨基安替比林分光光度法》(HJ503—2009)測定苯酚濃度。以不加菌種的培養基做空白對照。

將4 ℃保存的菌株加到含苯酚的無機鹽培養基中，在一定條件下培養，每隔2 h采用UV-2000型紫外可見分光光度計測定培養液在600 nm處吸光度值OD600，以評價細菌的生長情況。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離與初步鑒定結果

經過馴化篩選等系列實驗挑選出9株單菌，分別將其接種到含苯酚的無機鹽培養基中，測定苯酚濃度，其中有1株單菌的生長情況明顯優于其他菌株，命名為P1。

菌株P1在苯酚無機鹽平板上置于30 ℃恒溫培養箱培養24 h后，長出的菌落外形呈圓形，不透明，為乳白色，表面濕潤黏稠。對P1進行革蘭氏染色，呈陽性，通過細菌鑒定手冊[10]及生理生化特征實驗初步鑒定為微球菌屬(Micrococcussp.)，其部分生理生化特征見表1。

表1菌株P1的生理生化特征

Table1PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofStrainP1

名稱淀粉水解甲基紅糖發酵吲哚V-P結果+-++-

注：“+”為陽性，“-”為陰性。

2.2 菌株P1苯酚降解特性的影響因素分析

2.2.1 培養基初始pH值

在37 ℃、170 r/min、接種量為3%、苯酚濃度為500 mg/L的條件下，考察培養基初始pH值不同時菌株P1對苯酚的降解效果，如圖1所示，其中空白組pH值約為7.0。由圖1可見，最適合菌株降解苯酚的培養基初始pH值為7.0，此條件下經過24 h，苯酚降解率基本可達100%。當培養基初始pH值為7.0～9.0時，溶液呈中性或弱堿性，這時菌株P1對苯酚的降解效果明顯優于pH值為5.0時的降解效果，表明菌株P1對苯酚的降解更適合在中性或弱堿性環境下進行。這是由于在苯酚的降解過程中產生了偏酸性的中間代謝產物鄰苯二酚[11]，使弱酸性培養基進一步酸化，抑制了菌株的代謝，而在偏堿性的培養基中，苯酚代謝產生的偏酸性鄰苯二酚恰好使培養基得到了中和。

圖1 不同初始pH值下菌株P1對苯酚的降解效果

Fig.1Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferentpHvalues

2.2.2 培養溫度

在初始pH值為7.0、170 r/min、接種量為3%、苯酚濃度為500 mg/L的條件下，考察培養溫度不同時菌株P1對苯酚的降解效果，如圖2所示，其中空白組培養溫度為30 ℃。由圖2可見，在0～5 h內，溫度對P1的降解能力影響不大，但隨著培養時間的延長，不同溫度下P1的降酚能力就有了明顯區別，且35 ℃時P1對苯酚的降解效果最好。

圖2 不同培養溫度下菌株P1對苯酚的降解效果

Fig.2Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferenttemperatures

2.2.3 搖床轉速

在35 ℃、初始pH值為7.0、接種量為3%、苯酚濃度為500 mg/L的條件下，考察搖床轉速不同時菌株P1對苯酚的降解效果，如圖3所示，其中空白組搖床轉速為100 r/min。由圖3可見，0～8 h內，搖床轉速對菌株的降解效果沒有明顯影響，但隨著時間的延長，可以觀察到150～200 r/min為P1降解苯酚的最佳搖床轉速區間。

圖3 不同搖床轉速下菌株P1對苯酚的降解效果

Fig.3Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferentrotationspeeds

2.2.4 接種量

在35 ℃、150 r/min、初始pH值為7.0、苯酚濃度約為500 mg/L的條件下，考察接種量不同時菌株P1對苯酚的降解效果，如圖4所示。由圖4可見，培養初期，隨著接種量的增加，營養物質的消耗率增大，苯酚降解率也隨之增大。但過高的接種量會使微生物所分配到的營養物質減少，菌株生長代謝活動反而受到抑制。而接種量為1%～5%時，由于菌量較少，菌株平均分配到的營養物質較多，因此菌株繁殖速度較快，隨著培養時間的延長，其苯酚降解效果也越來越好，且接種量為3%時的苯酚降解效率又明顯比接種量為1%和5%時要高。綜合考慮，確定最優接種量為3%。

圖4 不同接種量下菌株P1對苯酚的降解效果

Fig.4Phenol-degradingeffectofStrainP1atdifferentinoculumsizes

2.2.5 金屬離子

在35 ℃、150 r/min、初始pH值為7.0、接種量為3%、苯酚濃度約為500 mg/L的條件下，考察培養基中加入不同金屬離子時菌株P1對苯酚的降解效果，結果如圖5所示，其中每種金屬離子的質量分數均為0.001%，空白組不加金屬離子。由圖5可見，菌株的生長受到金屬離子的明顯抑制，其中重金屬離子Hg2+對菌株的抑制尤為嚴重。另外，加入Hg2+的培養液中苯酚濃度出現略微升高，這可能是降解過程中生成了某種中間產物，它對指定波長的光也有吸收，而且比苯酚的摩爾吸光系數更大。

圖5 加入不同金屬離子時菌株P1對苯酚的降解效果

Fig.5Phenol-degradingeffectofStrainP1withdifferentmetalions

2.3 菌株P1的生長特性

在35 ℃、150 r/min、初始pH值為7.0、接種量為3%、苯酚濃度約為500 mg/L的培養條件下，菌株P1的生長曲線如圖6所示。由圖6可以看出，菌株P1在培養4 h后開始進入生長對數期，到約10 h后進入生長穩定期。因此10 h是菌株P1的生長對數期頂峰，也是降解苯酚的最佳時間。

圖6 菌株P1的生長曲線及苯酚降解曲線

Fig.6Growthcurveandphenol-degradingcurveofStrainP1

2.4 菌株P1對苯酚的降解動力學分析

為了深入探究菌株P1對苯酚的降解規律，在不同底物濃度下進行P1的苯酚降解動力學分析，如圖7所示。從圖7可以看出，苯酚初始濃度越低，降解所需時間越短；苯酚初始濃度為500 mg/L時，苯酚完全降解耗費的時間為12 h；苯酚初始濃度超過1000 mg/L時，菌體的生長速度以及苯酚的降解速度均非常緩慢。

菌株P1在12 h內可將濃度為500 mg/L的苯酚完全降解，其代謝速率約為43.05 mg/(L·h)，明顯優于馬海娟等[12]篩選得到的Nocardiasp.，該菌完全降解600 mg/L的苯酚需要20 h，也優于錢奕忠等[13]篩選出的菌種，該菌完全降解470 mg/L的苯酚需要耗費78 h。菌株P1的苯酚耐受濃度可達1200 mg/L。

圖7 菌株P1的苯酚降解動力學曲線Fig.7 Phenol-degrading kinetic curves of Strain P1

Monod方程作為描述單一基質限制生長的動力學方程，其零級、一級反應動力學方程常被用于代謝動力學表征。將圖7中的曲線用動力學方程表示，結果見表2。由表2可見，當苯酚濃度為100～500 mg/L時，苯酚的降解過程符合零級反應動力學方程，即dC/dt=-k；當苯酚濃度大于500 mg/L時，苯酚的降解過程符合一級反應動力學方程，即dlnC/dt=-k。

表2 菌株P1的苯酚降解動力學方程Table 2 Phenol-degrading kinetic equations of Strain P1

3 結論

(1)由某焦化廠活性污泥中馴化得到一株能以苯酚為唯一碳源生長的菌株P1，該菌株好氧，革蘭氏染色呈陽性，初步鑒定為微球菌屬(Micrococcussp.)。

(2)菌株P1對苯酚生物降解的較優條件為：初始pH值7.0，培養溫度35 ℃，搖床轉速150 r/min，接種量3%。菌株P1的生長受到一些金屬離子的顯著抑制，因此在用其處理含苯酚廢水時，必須考慮到廢水中的金屬離子對微生物的影響。

(3)當苯酚濃度為100～500 mg/L時，P1對苯酚的降解過程符合Monod零級反應動力學模型。

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