菌根真菌對白三葉根際團聚體穩定性、球囊霉素相關土壤蛋白和糖類物質的影響

吳強盛，袁芳英，2，費永俊，李莉，黃詠明

（1.長江大學園藝園林學院，湖北 荊州434025；2.京山縣農業局，湖北 荊門431800）

土壤結構指的是土壤團聚體和土壤孔隙建立的三維排列，控制著土壤水分、氣體和營養物質的流動，同時也影響根系對土壤養分和水分的吸收，進而影響整個植株的生長［1］。通常，團聚體穩定性和不同粒級團聚體的含量可用于土壤結構的評價［2］。研究顯示，植物根系以及土壤中一些微生物（包括叢枝菌根真菌）的菌絲和代謝產物（多糖和其他有機物）對土壤顆粒產生的膠結作用能夠使土壤形成穩定性團聚體，從而改善土壤結構［1，3－6］。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizas，AM）指的是土壤中 AM 真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）與80%的陸生高等植物根系形成的互惠共生體。AMF除了對宿主植物的營養和水分吸收、抗逆性、植物生長發育產生促進效應外，還可以提高植物根際土壤的理化性狀［7］。AMF侵染宿主植物后形成發達的根外菌絲，這種菌絲可將土壤顆粒機械地纏繞在一起而形成團聚體［4，6］，此外，AMF菌絲還能分泌一類特殊糖蛋白即球囊霉素相關土壤蛋白（glomalin－related soil protein，GRSP）［8］，其在土壤團聚體穩定性中扮演著重要的角色［1］。研究表明，接種摩西球囊霉（Glomusmosseae）和根內球囊霉（G.intraradices）處理增加了紫花苜蓿（Medicagosativa）根際GRSP含量，且GRSP與團聚體穩定性間呈極顯著正相關關系［9］。此外，菌根釋放的GRSP粘附土壤顆粒的能力比其他土壤糖類物質強3～10倍［10］，能把小的土壤顆粒粘成直徑＜0.25mm的微團聚體，進而形成穩定的大團聚體（＞0.25mm）。因此，增加植物根際GRSP的含量能夠改善土壤結構，從而有利于植物的生長。

在草地中，放牧作用通過家畜采食、踐踏從而減少穩定性團聚體，土壤結構遭到破壞，土壤退化［11－12］。白三葉（Trifoliumrepens）為豆科三葉草屬多年生牧草，由于其易于管理、生長快、固氮能力強等特點而被廣泛應用［13－14］，但也經常遭受土壤干擾，導致根際土壤結構變劣。本研究以白三葉為材料，通過接種2種AMF對其生長效應、葉綠素、根際土壤水穩性團聚體粒級的分布、團聚體穩定性、GRSP和糖類物質含量的影響，分析AMF和GRSP對團聚體穩定性的貢獻，為防止土壤退化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇白三葉作為植物研究材料。中國“叢枝菌根真菌種質資源庫”（BGC）提供的地表球囊霉（Glomusversiforme）和隱內球囊霉（Paraglomusoccultum）作為供試的AMF。菌根菌劑包含感染菌根的高粱（Sorghumvulgare）根段、根外菌絲、孢子以及沸沙的混合物。試驗土壤選自長江大學校內的黃棕壤，自然風干，過4mm篩，高壓蒸氣滅菌（121℃，0.11MPa，2h），以殺死原有的AMF孢子。2010年10月19日對白三葉種子播種，播種前預先采用70%酒精表面消毒5min，蒸餾水沖洗數次后，播種于白色塑料盆（上口徑16cm、下口徑11cm、盆高13 cm）基質表層0.5cm處，每盆點播35粒種子，5d后間苗至30株/盆。試驗盆放置在PQX人工氣候箱中，25℃白天/18℃晚上，16h光照/8h黑暗，空氣濕度85%，光通量密度800μmol/（m2·s）。

1.2 試驗設計

試驗由3個處理組成，分別包括接種地表球囊霉、接種隱類球囊霉和不接種叢枝菌根真菌（Non－AMF）的對照。對于AMF接種處理，每盆施入15g菌劑。每個處理重復4次，每盆30株白三葉，共12盆，隨機排列，定期對人工氣候箱中的試驗盆進行位置的置換，以減少擺放位置對試驗的影響。

1.3 測定方法

經過85d培養后結束試驗，隨機從每處理的重復中選取15株白三葉，分成地上部和地下部，于70℃下烘干48h，然后測定各自干重。剩余每盆15株的葉片混合，采用80%丙酮溶液提取，646和663nm波長下進行比色測定葉綠素含量［15］；少量根系，剪成1cm根段，經過10%KOH于90℃下透明30min，然后采用10%H2O2漂白10min以及0.2mol/L HCl酸化10min，0.05%曲利苯藍染色10min［7］，然后在生物顯微鏡下觀察，根系菌根侵染率用感染的根段長度占檢查根段總長的百分數表示。菌根依賴性用接種植株總干重與不接種植株總干重的百分比表示。

收集各處理的土壤，不同粒級團聚體比例的測定采用濕篩法［16］進行。稱取過4mm篩風干土樣30g，將土樣依次通過從上到下孔徑為2，1，0.5，0.25mm的網篩，在自來水下濕洗每個孔篩的土樣，殘留在各級網篩的土壤轉移到預先稱重的鋁盒中，于100℃下烘至恒重，稱重，然后計算各級團聚體的百分數。

團聚體穩定性采用平均質量直徑（mean weight diameter，MWD）表示［17］，具體計算公式如下：

式中，Xi為任一粒級范圍內水穩性團聚體的平均直徑（mm），Wi為Xi的水穩性團聚體百分含量。

土壤熱水提取碳水化合物（hot－water extractable carbohydrates，HWC）和土壤水解碳水化合物（hydrolyzed carbohydrates，HYC）含量采用蒽銅比色法［18］測定。取風干土樣0.75g，加蒸餾水5mL，沸水浴2h，冷卻后定容至50mL，吸取濾液1mL加入蒽酮試劑5mL，沸水浴15min，然后630nm波長下比色測量HWC的含量；取風干土樣0.5g，加入2.5mol/L的硫酸10mL，沸水浴加熱20min，過濾，定容（50mL），吸取濾液1mL，加入蒽酮試劑5mL，沸水浴15min，然后630nm波長下比色測量HYC的含量。

取1.0g風干土樣，分別用20mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 7.0）提取30min或者50mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 8.0）提取60min，提取條件為0.11MPa、121℃，然后再10000r/min離心5min，分別得到土壤易提取球囊霉素相關土壤蛋白（easily extractable glomalin－related soil protein，EE－GRSP）和總球囊霉素相關土壤蛋白（total glomalin－related soil protein，T－GRSP）的提取液［19］，然后采用Braford法［8］測定上清液中 GRSP的含量。

1.4 統計分析

運用SAS（8.1）軟件的ANOVA過程對處理間作差異性測驗，LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同AMF對白三葉菌根侵染率、生物量和菌根依賴性的影響

從表1可知，未接種AMF的白三葉根系沒有觀察到真菌的侵染，而接種兩個不同屬的AMF都侵染了白三葉根系，根系菌根侵染率在35%～75%，其中隱類球囊霉對白三葉根系的侵染率最高，與地表球囊霉間差異顯著。從表1還可以看出，與對照相比，兩個不同屬的AMF都顯著增加了白三葉地上部、地下部和植株總干重，接種處理間沒有表現顯著的差異。

表1 兩種AMF對白三葉菌根侵染率、生物量和菌根依賴性的影響Table 1 Effects of two AMF on mycorrhizal colonization，biomass production and mycorrhizal dependency of white clover

2.2 不同AMF對白三葉葉綠素含量的影響

圖1顯示了不同AMF接種處理對白三葉葉綠素含量的影響。結果可知，接種地表球囊霉和隱類球囊霉都顯著提高了白三葉葉綠素的含量，分別提高了16.2%和23.5%。

圖1 兩種AMF對白三葉葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of two AMF on chlorophyll content of white clover

2.3 不同AMF對白三葉根際水穩性團聚體的粒級分布和穩定性的影響

由表2可知，兩種AMF顯著地降低了1～2 mm粒徑土壤水穩性團聚體的含量，分別降低了52.4%和42.9%。然而，地表球囊霉和隱類球囊霉卻顯著增加了0.5～1mm粒徑土壤水穩性團聚體的含量，分別增加了43.8%和51.0%。地表球囊霉和隱類球囊霉也顯著增加了0.25～0.5mm粒徑土壤水穩性團聚體的含量，分別增加了72.5%和60.2%，兩種 AMF處理間差異顯著（P＜0.05），表現為地表球囊霉＞隱類球囊霉。此外，菌根真菌接種對白三葉根際平均質量直徑沒有顯著的影響。

表2 兩種AM真菌對白三葉根際土壤水穩性團聚體含量和平均質量直徑的影響Table 2 Effects of two AM fungi on water stable aggregate contents and mean weight diameter of white clover

2.4 不同AMF對白三葉根際GRSP和糖類物質含量的影響

接種地表球囊霉和隱類球囊霉顯著增加了根際土壤中EE－GRSP和T－GRSP含量，其中EE－GRSP含量分別被提高了28.6%和41.8%；T－GRSP含量分別被提高了26.9%和28.5%（圖2）。

接種地表球囊霉和隱類球囊霉也顯著增加了根際土壤中HWC的含量，分別增加了44.1%和14.7%，且地表球囊霉的增加效果最好，與隱類球囊霉間差異顯著（P＜0.05）（圖3）。隱類球囊霉顯著增加了根際土壤中HYC的含量，增加了44.7%，而地表球囊霉的效果不顯著，兩個菌種間的差異顯著（圖3）。

圖2 兩種AM真菌對白三葉根際土壤中球囊霉素相關土壤蛋白含量的影響Fig.2 Effect of two AM fungi on GRSP concentrations in rhizosphere of white clover

圖3 兩種AM真菌對白三葉根際土壤中糖類物質含量的影響Fig.3 Effect of two AM fungi on sugar concentrations in rhizosphere of white clover

2.5 白三葉根際GRSP與其他各指標間的相關性

表3顯示，EE－GRSP與AMF侵染率、0.5～1mm粒徑土壤水穩性團聚體、0.25～0.5mm粒徑土壤水穩性團聚體間分別存在極顯著的正相關關系（P＜0.01），與HYC間存在顯著的正相關關系（P＜0.05），與1～2mm粒徑土壤水穩性團聚體間存在極顯著的負相關關系（P＜0.01），但與2～4mm粒徑土壤水穩性團聚體、MWD和HWC間未達到顯著的相關關系。T－GRSP與0.5～1mm粒徑土壤水穩性團聚體、0.25～0.5mm粒徑土壤水穩性團聚體間分別存在極顯著的正相關關系（P＜0.01），與菌根侵染率、MWD和HWC間分別存在顯著的正相關關系（P＜0.05），與1～2mm粒徑土壤水穩性團聚體間存在極顯著的負相關關系（P＜0.01），而與2～4mm粒徑土壤水穩性團聚體和HYC間均未達到顯著的相關關系。

表3 EE－GRSP和T－GRSP與其他指標間的相關系數Table 3 Pearson correlation coefficients between EE－GRSP or T－GRSP and other variables

3 討論

3.1 AMF接種對白三葉生長的效應

本試驗結果表明，接種AMF都顯著增加了白三葉生物量（干重），且不依賴AMF種類，這與葉少萍等［20］在狗牙根（Cynodondactylon）上接種聚叢球囊霉（Glomusaggregatum）和摩西球囊霉的研究結果相一致。一般而言，菌根真菌對植物根系的侵染狀況越好，則對植物生長的促進作用也越顯著［21］。在本研究中，兩種AMF都能夠與白三葉根系建立良好的共生關系，特別是隱類球囊霉。已知植物90%～95%干物質積累源于光合產物［22］，同時AMF的侵染能夠明顯提高宿主植物葉綠素含量，使得植物制造光合產物的能力增加，因而提高植株生物量［23］，本研究也證明了這一點。

3.2 AMF接種對白三葉GRSP以及團聚體分布的效應

在本試驗中，接種AMF處理的白三葉根際土壤EE－GRSP和T－GRSP含量均顯著高于未接種處理的植株，且相關性分析顯示了EE－GRSP和T－GRSP與菌根真菌侵染率間有顯著或極顯著的正相關關系，這與Bedini等［9］在紫花苜蓿上接種摩西球囊霉和根內球囊霉的研究結果相一致，也暗示著AMF對根系的侵染能夠促進土壤中GRSP含量的提高，且優勢菌種（如本研究中的隱類球囊霉）效應更強，因為GRSP的釋放是源于菌根菌絲和孢子。GRSP與菌根侵染率的正相關關系對菌根改善土壤團聚體的穩定性具有重要的意義。已有研究表明，土壤中GRSP的含量與水穩性團聚體的百分含量正相關［24］。在本研究中，兩種AMF僅對小粒徑（0.5～1mm和0.25～0.5mm）土壤水穩性團聚體含量有顯著的促進效果，卻顯著抑制了1～2mm粒徑團聚體的形成。相關性分析也顯示，GRSP與小粒徑土壤水穩性團聚體間有極顯著的正相關關系，這說明GRSP對團聚體的效應依賴粒級大小：對＜1mm粒徑團聚體的形成有顯著的促進作用，對1～2mm粒徑團聚體的形成有顯著的抑制效應。Rillig等［25］在細莖針草（Stipatenacissima）生長土壤中也發現EE－GRSP和T－GRSP與1～2mm粒徑土壤水穩性團聚體含量呈負相關關系。

3.3 GRSP對白三葉根際團聚體穩定性和糖類物質的效應

研究發現，GRSP的主要作用是改善土壤團聚體的穩定性和增加土壤有機碳庫［4，26］。在本研究中，只有TGRSP與MWD呈顯著的相關關系，可能由于EE－GRSP的穩定性較T－GRSP差而易轉化為難提取的GRSP［27］，導致T－GRSP和EE－GRSP對團聚體穩定性的分工上的差異［19］。MWD是各級水穩性團聚體的綜合指標，其值主要隨大粒徑水穩性團聚體含量的增加而增大［17］，而本實驗結果顯示兩種AMF對白三葉根際土壤大粒徑的水穩性團聚體（＞2mm）含量的影響較對照差異不顯著，因而接種AMF后，MWD值增加不顯著。當然，團聚體穩定性除了依賴GRSP外，還依賴根系、菌絲、根系分泌物、土壤有機碳等多個因子［4，28］。因此，進一步地試驗還需明確各個因子對團聚體穩定性的貢獻。

由于AMF是從宿主植物（如本研究中的白三葉）獲取糖類物質（主要是己糖，特別是葡萄糖）進行相關代謝活動，生長的菌絲代謝產物包括GRSP［4］。本研究結果顯示，接種AMF處理顯著提高了白三葉葉綠素含量，暗示了接種植株合成了更多的糖類物質［29］，為菌根的發育提供了良好的碳源基礎。菌根分泌的球囊霉素是土壤碳庫的重要來源［4］。本試驗結果顯示，接種處理顯著增加了HWC和HYC含量（除地表球囊霉對HYC沒有差異外），其中EE－GRSP與HYC呈顯著的正相關關系，而T－GRSP與HWC呈顯著的正相關關系，這暗示著不同組分的GRSP對土壤不同類型糖類物質的貢獻不同。

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