谷氨酰胺對飼喂高精料的奶山羊瘤胃上皮的保護效應研究

劉玉潔，劉軍花，許婷婷，朱偉云，毛勝勇

（南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京210095）

瘤胃酸中毒是一種在反芻動物生產中發生率較高的營養代謝病，尤以高產奶牛和育肥牛最為常見，其主要誘因為動物采食過多精飼料或飼料中精粗飼料搭配不合理導致［1］。瘤胃酸中毒可損傷瘤胃上皮屏障，增加腸道通透性，激發宿主炎癥應答，誘發腸炎等營養代謝病，導致動物生產性能下降，給畜牧生產帶來極大的經濟損失。因此，探索有助于在高精料條件下保持瘤胃上皮屏障的正常生理功能的措施，對于保障動物生產性能的發揮及提高動物福利皆具有重要理論價值與應用意義。

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是血液循環和組織內游離氨基酸池中含量最豐富的一種氨基酸，Gln可為上皮細胞提供能源物質，具有維持機體酸堿平衡、促進氮平衡、保持腸黏膜完整、維持緊密連接蛋白的完整性、促進免疫細胞的增殖和防止細菌移位和腸道毒素血癥的功能［2］。在人和單胃動物腸道營養上的研究顯示，Gln可改善患者全身免疫功能和營養代謝狀態［3］，降低大鼠炎癥介質TNF－α、IL－6和內毒素水平［4］，可快速逆轉大鼠燒傷后緊密連接結構蛋白occludin、ZO－1表達下降，上調腸黏膜的屏障功能［5］。在反芻動物營養中的研究表明，Gln可為瘤胃上皮提供能量［6］，可提高犢牛小腸黏膜中DNA、RNA及蛋白質的含量，提高小腸黏膜細胞的生長速度［7］。借鑒Gln在上述人、單胃和反芻動物胃腸道營養領域中的相關進展，本研究提出如下假說：日糧中添加Gln可降低高精料對瘤胃上皮生理結構的損傷，在一定程度上改善受損瘤胃上皮的屏障功能。由此，本試驗擬利用飼喂高精料日糧的奶山羊為模型動物，研究添加Gln對山羊瘤胃發酵、瘤胃上皮形態結構、炎癥因子及緊密連接蛋白表達的影響，以期為Gln在奶牛養殖中的應用提供科學依據，為調控瘤胃上皮屏障的生理功能提供新思路。

1 材料與方法

實驗于2012年1－4月在南京農業大學動物房進行。

1.1 實驗動物及日糧

選用12頭健康、體重相近的2.5歲的經產薩能奶山羊母羊（41.5±0.8kg），統一驅蟲、單欄飼養。日糧按NRC標準配制（表1），精粗比為7∶3。山羊的采食量預設為1.3kg干物質。每日飼喂兩次（8：00和17：30），每次等量飼喂，自由飲水。按常規手術方法安裝永久性瘤胃瘺管。

1.2 試驗設計

采用隨機區組實驗設計，分別將12頭奶山羊隨機分為兩組，即不添加Gln的對照組和添加過瘤胃Gln（50 g/d）的處理組，每處理設6個重復。實驗期共29d，分別于第7，14，21，28天晨飼前（0h）和晨飼后（4h）采集瘤胃液。過瘤胃Gln由浙江康德全公司生產。

表1 日糧配方及營養水平Table 1 Ingredient and nutrient levels of the diets

1.3 樣品采集

在上述各取樣時間點，利用自制負壓裝置，分別從12頭奶山羊瘤胃瘺管各采集150mL瘤胃液，所采瘤胃液經4層紗布過濾后，將濾液置于潔凈的燒杯中，混合均勻后，立即測定瘤胃液pH，而后將瘤胃液轉入離心管中，－20℃凍存，備測揮發性脂肪酸濃度。在實驗期的第29天屠宰山羊后，迅速采集瘤胃腹囊部的上皮組織樣，用冰磷酸緩沖液清洗干凈后，將上皮組織分成3等份，第1份于液氮保存，用于RNA抽提；第2份用2.5%戊二醛固定，用于掃描和透射電鏡觀察；第3份用4%多聚甲醛固定，用于石蠟切片。

1.4 指標測定及方法

1.4.1 瘤胃發酵參數的測定 采用比色法測定瘤胃液乳酸濃度［8］，采用氣相色譜法（GC－14B氣相色譜儀，日本，柱溫110℃，氣化室溫度180℃，檢測室溫度180℃）測定揮發性脂肪酸濃度［9］。

1.4.2 組織切片的處理 用4% 多聚甲醛固定，洗滌、酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片、帖片、脫蠟復水、蘇木精－伊紅染色、封固，在光鏡下觀察瘤胃上皮形態的變化。

1.4.3 電鏡樣品的處理 用冰磷酸緩沖液反復清洗樣品，2.5% 的戊二醛固定后，磷酸緩沖液清洗，采用乙醇脫水后，冷凍干燥儀干燥樣品，用離子濺射儀鍍膜，掃描電子顯微鏡進行觀察（S－3000N，日本，HITACHI）。透射電鏡實驗中的樣品前處理與掃描電鏡預處理一致，綴以1%的鋨酸固定，乙醇梯度脫水，用丙酮置換后，浸漬、包埋、聚合，修塊使樣品表面積小于0.2mm×0.2mm，超薄切片，經鈾染色與鉛染色清洗后，透射電子顯微鏡（H－7650，日本，HITACHI）進行觀察。

1.4.4 炎癥因子及緊密連接蛋白表達量的測定 瘤胃上皮的總RNA的提取參照Chomczynski和Sacchi［10］，采用微量分光光度計（NANODROP 1000）測定總RNA濃度和純度。RNA反轉錄條件與引物參照Liu等［11］的文獻，反轉錄產物于－20℃儲存備用。采用實時熒光定量PCR儀（StepOnePlusTMReal－Time PCR System，Ap－plied Biosystems，美國）評估腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、γ干擾素（interferon－γ，IFN－γ）、白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、白介素－6（interleukin－6，IL－6）、白介素－10（interleukin－10，IL－10）、緊密連接蛋白occludin、claudin－1、claudin－4和ZO－1（zonula occludens－1）mRNA 的相對表達水平，基因表達量采用2－△△Ct法進行處理。

1.5 數據處理

瘤胃pH、揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）和乳酸濃度采用SPSS（SPSS version 18.0，Chicago，IL）軟件的混合模型統計，統計模型為：Xij＝μ＋Ti＋Pj＋T×Pij＋eij，式中，μ為常數項，各自變量均為0時Xij的平均數，Ti為日糧處理（i＝1～2），Pj為采樣期（i＝1～4），T×Pij為處理與采樣期間（period）的互作效應，各采樣時間點（Time）為重復因子，eij為隨機效應。瘤胃上皮中炎癥因子與緊密連接蛋白表達數據采用Independent T－test進行統計分析。將顯著性水平置于P＜0.05，0.05≤P＜0.1表示處理間存在統計趨勢。

2 結果與分析

2.1 高精料日糧中添加谷氨酰胺對奶山羊瘤胃發酵參數的影響

與對照組相比，添加Gln降低了瘤胃液中丙酸濃度（P＝0.004），有降低乳酸（P＝0.078）和提高丁酸（P＝0.059）濃度的趨勢，但對乙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發性脂肪酸濃度無顯著影響（P＞0.05），添加谷氨酰胺顯著提高了乙酸與丙酸的比值（P＜0.001）。除戊酸外（P＝0.103），采樣各期對揮發性脂肪酸有顯著影響（P＜0.01），除乙酸外（P＝0.022），采樣期與日糧間無顯著的互作效應（P＞0.05）（表2）。

表2 高精料日糧中添加谷氨酰胺對奶山羊瘤胃發酵參數的影響Table 2 The effects of glutamine addition on ruminal fermentation parameters of dairy goats fed high grain diet

2.2 高精料日糧中添加谷氨酰胺對瘤胃上皮形態的影響

光學顯微鏡的結果表明，對照組角質層的邊緣細胞發生破裂（圖1A），而Gln組角質層的細胞完整（圖1B）；掃描電鏡觀察可見，對照組瘤胃上皮出現大面積的坍塌（圖1C），Gln組角質層有更深更長的裂隙（圖1D）。透射電鏡觀察顯示，對照組細胞間的連接不緊密，呈彌散狀（圖1E），Gln處理組細胞間的連接緊密（圖1H）；對照組的顆粒層細胞核萎縮，甚至空泡無核（圖1F），Gln組細胞核呈卵圓形，無空泡（圖1I）；對照組的基底層細胞萎縮，富含大量角質化顆粒（圖1G），而Gln處理組的基底層細胞呈立方形，結構完整（圖1J）。

2.3 高精料日糧中添加谷氨酰胺對奶山羊瘤胃上皮炎癥因子基因表達的影響

由表3可見，添加谷氨酰胺顯著降低了奶山羊瘤胃上皮TNF－αmRNA的表達量（P＜0.05），但對瘤胃上皮內IFN－γ、IL－1β、IL－6和IL－10mRNA的相對表達量無顯著影響（P＞0.05）。

圖1 谷氨酰胺對瘤胃上皮形態的影響Fig.1 The effect of glutamine addition on changes in histomorphology of rumen epithelia

表3 高精料日糧中添加谷氨酰胺對奶山羊瘤胃上皮中炎癥因子mRNA相對表達量的影響Table 3 Effect of glutamine supplementation on the mRNA relative expression of inflammatory cytokine of rumen epithelium in dairy goats fed the high grain diet

2.4 高精料日糧中添加谷氨酰胺對奶山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

由表4可見，高精料日糧中添加Gln對緊密連接蛋白claudin－1、claudin－4、ZO－1mRNA 的表達量無顯著影響（P＞0.05），但添加Gln可顯著提高瘤胃上皮occludin mRNA的表達量（P＜0.05）。

3 討論

瘤胃是反芻動物免疫系統的重要組成部分，瘤胃上皮屏障在維持離子吸收所必需的濃度梯度，以及在阻止瘤胃微生物、脂多糖和其他毒物因子的移位方面起著重要屏障作用［12］，飼喂高精料可導致瘤胃上皮角質層出現坍塌［13］，細胞間的連接受損，間隙變大，顆粒層的厚度減少［14］，最終使瘤胃上皮屏障受損，瘤胃內的內毒素發生移位。內毒素進入血液循環系統后，通過致宿主炎癥應答，導致動物生產性能下降，乳品質降低［15］，給畜牧生產造成了極大的經濟損失。在本研究中，對照組中瘤胃上皮緊密連接受損，胞內間隙變大，顯示瘤胃上皮的正常屏障結構發生改變，該結果達到了預期實驗目的，也與上述報道一致。

表4 高精料日糧中添加谷氨酰胺對奶山羊瘤胃上皮緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響Table 4 The effect of glutamine addition on the tight junction mRNA relative expression levels of rumen epithelium in dairy goats fed high grain diet

研究表明，當動物處于應激狀態時，體內新合成的Gln不能滿足機體的需要，Gln的不足會導致絨毛萎縮，黏膜潰瘍，小腸細胞壞死，而添加Gln有利于維持腸上皮結構完整［2］。本研究中，對照組的瘤胃上皮連接受損；但添加Gln組的山羊瘤胃上皮超微結構完整，細胞間連接緊密、界限清晰，胞核完整。結果說明添加過瘤胃Gln可維持瘤胃上皮結構完整，本實驗結果與單胃動物上的結果基本一致。

緊密連接是瘤胃上皮屏障中的重要結構，對維持上皮細胞極性、調節上皮屏障的通透性和阻止瘤胃細菌、內毒素和其他毒性大分子物質進入體內發揮著重要作用［16］。體外研究發現，caco－2細胞在缺乏Gln時，導致claudin－1和occludin的表達量下降，二者在細胞間重新排布［17］；而采用Gln處理可顯著減緩乙醛誘導的人結腸黏膜中細胞間連接的occludin和ZO－l重新分布［18］。本研究表明，補充Gln能逆轉緊密連接蛋白occludin表達的下降，其機制可能與Gln降低了炎癥因子的生成有關。在山羊上的研究顯示，瘤胃上皮組織中炎性細胞因子TNF－α、IFN－γmRNA的表達量與緊密連接蛋白表達量呈顯著相關［11］。對三硝基苯磺酸誘導結腸炎的小鼠給予Gln處理，發現Gln可減輕TNF－α的產生、釋放［19］。此外，前人研究表明，通過皺胃灌注Gln，可提高奶牛血漿中Gln含量［20］。因此，本實驗中，添加的過瘤胃Gln在腸道吸收后，通過血液循環可進入瘤胃上皮系統。在小鼠和豬上的研究表明，Gln可降低炎癥反應［19，21］。在奶牛的研究顯示，應用Gln可提高宿主的免疫應答［22－23］。由此，進入瘤胃上皮系統的Gln可通過降低上皮組織中的炎癥反應，削弱炎癥因子對上皮屏障的損傷，從而維持瘤胃上皮超微結構的功能。增強的上皮屏障可阻止病原菌及內毒素等致炎因子進入血液，從而進一步降低瘤胃內源性毒物因子導致的炎癥反應，該推測也與實驗結果一致。本研究中，促炎癥因子TNF－αmRNA表達量顯著降低，同時谷氨酰胺組瘤胃上皮結構完整。上述結果說明，高精料日糧中添加Gln可下調瘤胃上皮中部分炎癥因子的表達，降低高精料日糧對瘤胃上皮屏障的損傷。

本研究中，添加Gln降低了瘤胃液中丙酸和乳酸濃度，提高了丁酸濃度，其結果可能與Gln間接影響了瘤胃內揮發性脂肪酸的排空、瘤胃上皮內VFA的代謝及瘤胃微生物區系平衡等有關。在瘤胃中，VFA的排空主要通過瘤胃上皮吸收與瘤胃向網胃的流動實現。瘤胃上皮的吸收主要有自由擴散及載體轉運兩種方式。在本研究中，丙酸含量降低可能與瘤胃上皮的吸收加快有關。在正常生理下，丙酸是反芻動物體內的主要糖前體物，機體可能通過加快對其的吸收來滿足機體的正常代謝，結果導致瘤胃內丙酸濃度下降。丁酸作為一類重要的細胞能源物質，能夠抑制瘤胃上皮的凋亡，促進瘤胃上皮的增殖［24－25］。在正常生理條件下，瘤胃上皮細胞內丁酸濃度是非常穩定的，但在病理條件下，機體常通過補償代謝以最大程度的維持細胞的完整性［14］。本實驗中，對照組的上皮結構被破壞，瘤胃上皮的凋亡速度加快，機體為最大程度的維持上皮結構的穩定，需要大量的能量以促進瘤胃上皮細胞的生長，這可能引起瘤胃中丁酸的吸收速度加快，從而導致對照組中瘤胃內丁酸濃度低于Gln組。本研究中，乳酸含量的變化可能與瘤胃內的微生物群體變化相關，但由于本研究未進一步研究瘤胃中乳酸利用菌的變化，該方面的具體機制尚不清楚。但本研究結果顯示，添加Gln可改變瘤胃內部分VFA的濃度和發酵方式（乙丙比發生改變），其機制可能與Gln間接影響了瘤胃上皮生理功能及瘤胃內環境等有關。

4 結論

在飼喂高精料的奶山羊日糧中添加過瘤胃Gln可維持瘤胃上皮形態結構完整，降低瘤胃上皮的炎癥反應，改善緊密連接，并在一定程度上影響瘤胃內VFA的組成。結果說明，日糧中應用過瘤胃Gln有助于降低高精料對瘤胃上皮屏障功能的損傷。

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