分子診斷技術在傳染病病原體檢測中的應用

王升啟

·導向與述評·

分子診斷技術在傳染病病原體檢測中的應用

王升啟

傳染病病原體的準確檢測是傳染病有效防控的前提，也是合理用藥的基礎。然而，傳統的病原體分離、培養等診斷方法不能完全滿足臨床治療和疾病控制的需要。新發展的傳染病分子診斷技術可有效彌補傳統方法的不足。本文就新一代測序、核酸擴增、生物芯片和生物傳感等傳染病分子診斷新技術及其應用研究進展進行綜述。

分子診斷技術；基因擴增；高通量核苷酸測序；微點陣分析；生物傳感技術；傳染病

本文對新一代測序、生物芯片、核酸擴增和生物傳感四類分子診斷技術進行綜述。

1 新一代測序技術

1.1 病原體培養物樣本的基因組測序獲得病原體整個基因組，是最精確的病原體確證手段。從感染病例分離培養的病原體經過核酸提取、文庫構建以及定量質控后，通過新一代測序技術可以快速得到病原體基因組，從而實現對病原體的精確鑒定，快速發現基因組標志物用于檢測試劑盒的研發，非常有利于突發疫情的快速反應。同時，通過病原體基因組信息可實現溯源分析和耐藥/毒力基因分析，深入解析疫情傳播機制。2011年5月，德國出現出血性大腸桿菌O104:H4疫情。華大基因在獲得培養菌株的核酸后，3 d完成了7次二代測序實驗，5 d后O104:H4菌株的基因組草圖就在NCBI核酸數據庫公布?；谠摂祿? d后便研發出了診斷試劑盒，并在2周內由全球研究人員發布了24篇研究報告（毒力、耐藥、進化等），極大促進了該疫情的防控[1]。同年7月，荷蘭暴發由超級耐藥肺炎克雷伯菌Oxa48株導致的疫情，德國明斯特大學獲得樣本2 d后，便完成2株細菌的全基因組測序，并迅速發現特異序列用于臨床排查試劑盒的開發。Science雜志對新一代測序技術在這兩場疫情中發揮的作用給出了高度評價，指出新一代測序技術已成為基因組時代應對突發公共衛生事件的主流技術[2]。然而，由于新一代測序技術的高成本和復雜度，目前還不能在一線臨床機構如醫院檢驗科進行推廣。如今，各測序儀廠商都在積極進行臨床申報，但是自動化建庫工作站和數據分析軟件等配套系統都亟待完善。高通量測序全面用于臨床病原體確認還需要一定的時間。

1.2 非培養樣本病原體的檢測新一代測序技術還可用于非培養樣本病原體的檢測。由于新一代技術不需要對病原體有預先假設，非常適合非培養樣本中“未知”病原體的檢測，可實現其他技術無法克服的檢測難題。但是，樣本中絕大部分為宿主和正常菌群的核酸背景，病原體信噪比極低，須要依賴先進的樣本處理和生物信息學技術實現大海撈針式的病原體檢測工作，具有較大的挑戰性。2008年，瑞典斯德哥爾摩Karolinska醫學院的醫生和研究者遇到1例疑難病例，3例接受了來自同一供者器官的移植手術患者，在手術后4～6周均持續發熱并相繼死亡，而且并無明顯的免疫反應。采用常規細菌和病毒培養、多種病原體PCR檢測試劑盒以及病毒和細菌病原體微陣列芯片都未發現可疑病原體。于是，研究者從2例患者組織中提取了RNA，采用454測序儀進行新一代測序，經一系列生物信息學過濾和分析后，最后發現14條組裝片段同舊世界沙粒病毒（old world arenaviruses）序列同源（約80%同源性），后經多種生物實驗手段驗證后，確證了該病毒病原體在3例患者體內廣泛存在[3]，該項工作也成為新一代測序技術鑒定“未知”病原體的開山之作[4-5]。之后，多家機構采用該研究思路，也發現或確證了多種傳染病病原體[6-9]。新一代測序技術還被用于疑似病例的病原體排查。如2012年，斯坦福大學研究者對烏干達123例疑似登革熱患者血清進行新一代測序并最終確證37%的陽性患者（登革熱病毒占僅總樣品量的0.002%～2.800%）[10]。然而，這類工作目前還主要停留在從非培養樣本中得到病原體的基因組片段，而從非培養樣本中直接得到病原體整個基因組還存在較大的挑戰[11]。由于技術的挑戰性，新一代測序全面用于臨床非培養樣本檢測的可能性較小。但是，通過一線臨床工作者和研究人員密切合作，利用新一代測序解決疑難感染病例問題，具有較高的可行性。

2 生物芯片技術

生物芯片技術是指通過微加工技術在平方厘米大小的固相介質表面或液相介質中構建微型分析系統，根據分子間特異性相互作用的原理，實現對蛋白質、核酸等分子的準確、快速、高通量、平行化和自動化檢測[12]?；蛐酒?、蛋白質芯片和芯片實驗室都屬于生物芯片的范疇[13]。與傳統的檢測技術相比，生物芯片具有準確、快速、高通量的優勢，在病原微生物感染鑒別診斷、基因分型及耐藥檢測等傳染病分子診斷領域應用廣泛[14]，目前已有多種生物芯片產品獲批應用于臨床診斷。

2.1 病原微生物感染鑒別診斷病原微生物種類眾多，臨床和疾病控制中心都存在感染鑒別診斷的需求。生物芯片技術具備高通量的優勢，可同時檢測多個標志物，篩查多種病原體，目前已有多種產品問世[15]。丙型肝炎分片段抗體檢測蛋白芯片，選取HCV核心抗原NS3/NS4/NS5為檢測探針，經過3家單位臨床考核證明與ELISA法符合率達99%，且準確性高于ELISA法，與RIBA試劑符合率為98%，可用于HCV的感染確證[16]。這是國際上第一個基于硅基材料的獲得注冊證書的市場準入生物芯片產品。

2.2 病原微生物基因分型同種病原微生物不同基因型可導致疾病及預后的進展不同[17]，因此，針對型特異性核酸序列利用生物芯片技術進行基因分型具有重要意義。如HBV基因分型檢測試劑盒（基因芯片法），可區分A～G共8個基因型別[18]，可用于人血清或血漿樣本中HBV的基因分型檢測。盡管分子分型中基因測序是“金標準”，但基因芯片技術與測序技術相比的優勢在于靈敏度高，如一些含量較低的微生物，從原始標本中直接擴增出可滿足測序要求的基因片段有較大困難，但應用了信號放大的基因芯片技術可以完成低拷貝數模板的檢測。

2.3 病原微生物耐藥檢測生物芯片技術不僅可檢測特異性基因，還可用于檢測單核苷酸多態性，已有多種微生物耐藥檢測產品問世[19]。如HBV核酸及YMDD變異檢測基因芯片試劑盒，可同時分析HBV多聚酶突變位點528、552及555突變，共檢測了2425例血液標本，芯片結果與測序結果的符合率為98.1%，這是國際上第一個HBV耐藥檢測基因芯片，可為臨床醫師提供HBV感染者的抗病毒用藥參考[20]。結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒（DNA微陣列芯片法），可檢測利福平和異煙肼的3個耐藥相關基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動子的野生型及不同突變型，用于定性檢測來源于臨床疑似結核病患者經過分離培養的結核分枝桿菌分離株樣本中的核酸及藥物敏感性（藥敏）情況，在脊柱結核標本檢測中，該芯片檢測利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為88.9%和90.7%，檢測異煙肼耐藥的靈敏度和特異度分別為80.0%和91.0%[21]。該方法與傳統的結核菌培養和藥敏實驗相比，可提前至少4周報告結果，對疑似結核病患者的早確診和早治療具有重要意義。

2.4 生物芯片信號檢測技術生物芯片技術在傳染病檢測領域具有廣闊的應用前景，但現有芯片技術靈敏度低和設備要求高是推廣應用的瓶頸。在此背景下，芯片技術的信號檢測領域近年來也取得了一些研究進展?；谟袡C熒光的芯片信號檢測方法成熟、簡便，能夠達到一般的檢測要求。但熒光芯片也存在缺點，如熒光易淬滅、檢測靈敏度不足，且信號檢測需要激光共聚焦掃描儀等特殊儀器。Wang課題組發明了一種新型納米金復合底物Nanogold-DAB，HRP，能夠直接催化此復合底物反應使大量納米金特異沉積，再通過銀染色增強，建立起可視化生物芯片檢測方法[22]。該技術不僅提高了檢測靈敏度，而且也實現了檢測儀器的低成本化、小型化，有利于生物芯片技術的推廣應用，預計2015年會有系列可視化生物芯片產品獲準上市。

3 核酸擴增技術

3.1 實時熒光PCR檢測技術實時熒光PCR檢測技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，因其準確、快速、靈敏等特點被國際公認為傳染病相關病原微生物實驗室確證的最有效手段，獲批產品眾多，近年來該技術在新突發疾?。▏乐丶毙院粑C合征、甲型H1N1流感等）的確證、常規病原體的檢測和診斷中均發揮了不可替代的作用[23-24]。

熒光PCR的化學原理可分為3個基本類型：DNA結合染料法、探針法和猝滅染料引物法[25]。前2種方法均可檢出引物二聚體等非特異反應產物，特異性不強，因此在傳染病的臨床診斷中應用極少。在傳染病的分子診斷中一般建議采用探針法。探針法依賴熒光共振能量遷移實現檢測，包括TaqMan探針、分子信標、蝎型探針和復合探針等，該法僅檢測特異性擴增產物，因此特異性強。目前應用最廣泛的為TaqMan探針技術，WHO公布的甲型HIN1流感及人感染H7N9禽流感防控指南中推薦的熒光PCR檢測方法均采用的是TaqMan探針技術。復合探針技術是國內惟一具有自主知識產權的熒光PCR方面的核心探針技術，具有噪聲信號低、靈敏度高等優點，目前該課題組基于該技術已開發出了系列的傳染病診斷試劑。

3.2 核酸等溫擴增技術核酸等溫擴增技術是近年來發展迅速的一種體外核酸擴增技術，與PCR技術不同的是其擴增反應始終在一個溫度下進行，無須控溫精密的實驗儀器和復雜的實驗程序，其操作簡便、反應快速、檢測靈敏度高，在臨床和現場快速診斷中顯示了良好的應用前景。目前已有的等溫技術包括環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）、依賴核酸序列等溫擴增（nuclear acid sequence-based amplification,NASBA）、鏈替代等溫擴增、滾環等溫擴增、依賴解旋酶等溫擴增、單引物等溫擴增和核酸快速等溫檢測放大等。在傳染病病原檢測方面應用較多的有LAMP、NASBA等。LAMP目前已成功應用于EV71、結核分枝桿菌、登革熱病毒、黃熱病毒等的檢測[26-27]，NASBA已應用于細菌、病毒等多種病原微生物的檢測，包括HIV和HCV等[28-29]。LAMP用4條引物識別6個位點，特異性強，但引物設計要求較高，且擴增產物不能用于克隆測序，易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測結果。NASBA反應成分比較復雜，3種酶的使用增加了反應成本，且不適合DNA類病原檢測。

4 生物傳感技術

生物傳感器是一種由生物感應元件和信號處理元件組成，用于檢測各種生物和化學物質的反應系統。生物傳感器利用生物感應元件與目標檢測物之間相互作用產生響應信號，通過信號處理元件對響應信號進行接收、加工、轉換和輸出，以此實現對目標物的分析檢測[30-31]。近年來，基于功能納米材料的生物傳感器呈現出體積更小、檢測速度更快、靈敏度更高和可靠性更好等優異性能，在傳染病臨床診斷等諸多領域有著十分廣闊的應用前景。

表面增強拉曼散射（surface-enhancedRamanscattering,SERS）是一種特殊的表面光學現象，具有選擇性強、靈敏度高、特異性好等優點，可從分子水平檢測吸附在金屬表面的物質并提供物質獨特的指紋震動峰，在很多領域都得到實際應用。Wang課題組將一端帶有拉曼信號分子的“發卡環”結構DNA分子探針固定在金納米球微陣列芯片表面，利用分子探針捕獲高致病性禽流感H5N1的RNA標識物并發生開環反應，通過SERS的變化來實現RNA的定量檢測，可以實現樣品RNA的非擴增直接檢測[32]。

SERS技術已被廣泛應用于病理診斷，使傳染病病理不再局限于形態學觀察，而是深入到分子水平和遺傳水平研究疾病，實現結構-功能的分析。而SERS技術與核酸雜交技術的結合，使分子雜交技術在定量化以及高通量等方面日趨完善。目前生物傳感器檢測傳染性病原體仍處于實驗室探索研究階段，必須注意到它的若干不足，例如:①體積大、現場檢測困難；②難以實現高通量和超靈敏度的同時檢測；③設備價格貴、使用成本高；④抗干擾能力差、可靠性低；⑤無法實現直接在原始生物樣品（如血清、水等）中的檢測。這都限制了生物傳感器在病原體檢測中的應用，因此至今尚無可靠的商業化傳感器走向市場。隨著現代電子學、微加工技術、生物技術和納米科學等相關領域的發展，為生物傳感器的發展提供了新的機遇和方向。傳感器的構建使檢測方法將得到進一步改善，可縮短檢測時間，提高靈敏度，降低檢測限，實現微型化及便攜，達到快速、靈敏、方便、成本低等實際檢測應用的要求。

5 總結與展望

目前，高通量測序應用于病原體檢測的主要問題包括成本高、操作復雜以及后續分析軟件不完善，而解決這些問題也是高通量測序在該領域的發展方向。例如，現在測序儀生產商都在大力開發自動化建庫設備，甚至準備將其與測序儀整合；而生物信息學專家也在大力開發工業級和醫用級軟件，相信在不久的將來，高通量測序亦能成為病原體檢測的一項主流技術。集樣品處理、目標分子擴增、信號檢測、結果分析和報告于一體的高集成生物芯片技術和產品的研發是傳染病分子診斷用生物芯片領域亟待解決的技術難題，生物芯片技術也正向集成化、微型化、微量化、全自動化、定量化和數據庫完善化方向發展。功能納米材料生物傳感器檢測目前主要停留在實驗室研究階段，若要用于傳染病的現場檢測，還須解決抗體等敏感材料容易失活、信噪比較低、檢測的重復性和穩定性不高等問題。未來功能納米材料生物傳感器在傳染病現場檢測中的發展趨勢將會集中于研發新型試劑和納米材料，提高抗體等生物材料的長時間保存活性，并能放大檢測信號，降低檢測背景，提高信噪比，從而進一步提高檢測的靈敏度、準確度及傳感器的穩定性。此外，我國傳染病分子診斷領域目前還存在以下幾個突出問題：第一，缺乏自主創新的分子診斷新技術；第二，已有分子診斷產品的標準化程度不足，缺乏統一標準等原因導致部分產品質量無法保證，影響檢測結果的可靠性；第三，特殊病原體分子診斷產品仍然較少，獲得注冊證書的更少。上述問題的逐步解決，將有力推動我國傳染病分子診斷產業的發展。

志謝本文整理和撰寫過程中得到倪銘、劉琪琦、陳蘇紅、肖瑞和汪崇文等的大力支持，在此表示感謝

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（2014-07-13收稿 2014-08-30修回）

（責任編委 曲 芬 本文編輯 王 姝）

App lication ofmolecular diagnostic techniques to the detection of infectious diseases

WANG Sheng-qi
Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Key
Laboratory of New Molecular Diagnosis Techniques for Infectious Diseases,Beijing 100850,China

Fast and accurate detection of infectious pathogens is the premise of effective prevention and control of infectious diseases and also the basis for rational use of drugs.However,the traditional diagnostic methods such as isolation and culture of pathogens can not fully meet the needs of clinical therapy of infectious disease and the disease control.The newly developed rapid diagnostic techniques can effectively compensate for the lack of traditional methods.The progress of the application of nextgeneration sequencing,nucleic acid amplification,biochip and biosensor in the infectiousdiseasesdiagnosis is reviewed in thisarticle.

molecular diagnostic techniques;high-throughput nucleotide sequencing;microarray analysis;gene amplification; biosensing techniques;communicable diseases

R349.7

A

1007-8134(2014)05-0266-04

100850，軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所全軍暨北京市傳染病分子診斷新技術重點實驗室（王升啟）