125I測定低水平P-選擇素平面位點(diǎn)密度新方法

凌穎琛，李趣歡，黃 冰，張金赫，方 穎

(1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510010)

在感染部位或毒性刺激下，血液中的循環(huán)白細(xì)胞黏附在內(nèi)皮細(xì)胞表面并遷移進(jìn)入內(nèi)皮下組織，從而實(shí)現(xiàn)殺滅病原體及組織修復(fù)的作用[1]。P-選擇素為選擇素家族中的一員，它通過與配體PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand)的相互作用，介導(dǎo)白細(xì)胞的初始拴縛(tether)和隨后的滾動粘附(rolling)過程[2]。通常，人們利用平行平板流動腔(parallel plate flow chamber，PPFC)實(shí)驗(yàn)來體外模擬循環(huán)白細(xì)胞黏附，并測定黏附分子間的二維反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)[3-5]。在流動腔實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞流經(jīng)鋪有一定密度的P-選擇素底板，并與之發(fā)生相互作用。二維逆反應(yīng)速率可通過初始拴縛實(shí)驗(yàn)直接測量單分子鍵的生存時(shí)間(lifetime)而得到；分子間的正反應(yīng)速率與受體、配體的濃度、細(xì)胞接觸面積、分子擴(kuò)散等因素相關(guān)[5-6]。因此，準(zhǔn)確測定流動腔底部P-選擇素的位點(diǎn)密度，是在分子水平上采用流動腔實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附事件的關(guān)鍵的第一步。

1 放射性標(biāo)記法與SPECT簡介

通過熒光或125I放射性標(biāo)記的方法，可獲得細(xì)胞表面PSGL-1的位點(diǎn)密度。已有文獻(xiàn)報(bào)道了白細(xì)胞和HL-60細(xì)胞表面的PSGL-1分子個(gè)數(shù)分別為11 000±2 000和18 000±2 000[7]，其位點(diǎn)密度分別為49 sities/μm2和36 sites/μm2。然而，P-選擇素鋪于流動腔底部平面的玻璃板上，單黏附分子鍵介導(dǎo)的瞬時(shí)黏附實(shí)驗(yàn)要求位點(diǎn)密度小于10 sites/μm2[8]，以致熒光檢測方法的靈敏度難以滿足實(shí)驗(yàn)要求；雖然125I放射性標(biāo)記的敏感度較高，但傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)器一般只用于探測獨(dú)立試管中溶液的放射量，而非一個(gè)平面或蓋玻片上的放射量。

Infinia Hawkeye 4 ECT是一款多功能核素成像設(shè)備，它能執(zhí)行單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(single photon emisson computer Tomography，SPECT)，是集SPECT/PET/CT三位一體的多功能分子影像設(shè)備，能完成100%的SPECT和90%的PET/CT功能，可進(jìn)行影像的ECT和CT同機(jī)融合定位以及全能量范圍核素衰減校正等功能[9]，而且它還可同時(shí)對不同濃度的多個(gè)樣品進(jìn)行檢測，大大縮短檢測所需時(shí)間。因此，在本研究中，采用125I放射性標(biāo)記方法，利用SPECT儀器，對平面吸附的P-選擇素進(jìn)行位點(diǎn)密度測定。通過對物理吸附于玻璃及聚苯乙烯(Polystyrene，PS)的P-選擇素的位點(diǎn)密度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)P-選擇素的位點(diǎn)密度與吸附濃度呈線性關(guān)系，在玻璃上的吸附效率略高于聚苯乙烯；普通物理吸附后的P-選擇素的方向是隨機(jī)的，只有大約10%的P-選擇素呈現(xiàn)易于與細(xì)胞表面PSGL-1結(jié)合的朝向，即結(jié)合位點(diǎn)暴露的頭部向上。

2 材料與方法

2.1 IODOGEN法標(biāo)記蛋白

實(shí)驗(yàn)中用于標(biāo)記的蛋白有人類P-選擇素/Fc嵌合體和鼠抗人P-選擇素單克隆抗體9E1，均購自R&D system Inc，MN。進(jìn)行碘化反應(yīng)時(shí)，將40 ～ 150 μg蛋白(按150 kDa的IgG分量計(jì)算，106 kDa的P-選擇素嵌合體則為30～100 μg)溶解在100 μL的Tris緩沖液(25 mmol Tris-HCl，pH 7.5，0.4 mol NaCl)中，置于帶蓋的EP管中。在pierce pre-coated iodination tube(購自Thermo Fisher Scientific Inc，IL)中加入1 mL的Tris緩沖液，潤濕后倒掉，之后將100 μL高濃度Tris緩沖液(0.125 mol Tris-HCl，pH 6.8，0.15 mol NaCl)直接加入Iodination Tube的底部，并防止讓溶液接觸試管管壁。在通風(fēng)櫥中，將10 μL(1.0 μCi)的Na125I加入到iodination tube中，室溫活化6 min，每30 s旋轉(zhuǎn)試管1次。將活化后的碘化物加入到蛋白溶液中，室溫反應(yīng)6～9 min，每30 s輕輕晃動試管1次。最后，加入50 μL終止反應(yīng)溶液(含10 g/L酪氨酸的Tris緩沖液，pH 7.4)，混合并孵育5 min，在1 min和4 min時(shí)輕輕晃動試管1次。

2.2 標(biāo)記蛋白純化

實(shí)驗(yàn)前，用20 mL的Tris緩沖液對10 mL葡聚糖凝膠G-25填充的層析柱進(jìn)行沖洗和平衡。將碘化反應(yīng)的產(chǎn)物加入層析柱中，用Tris緩沖液對層析柱進(jìn)行洗脫，每0.5～0.8 mL收集1管，共收集25管。用Infinia Hawkeye 4 ECT和Pierce BCA蛋白定量試劑盒(thermo fisher scientific inc，IL)分別測定放射量和蛋白量的比值。

2.3 測定P-選擇素吸附的位點(diǎn)密度

研究中使用的吸附表面有聚苯乙烯(PS)和玻璃兩種，其中以Costar 48-孔板(corning inc，NY)作為PS吸附材料，將玻璃蓋玻片用玻璃膠固定在6-孔板內(nèi)作為玻璃吸附材料。在2 mm厚的硅膠墊上裁剪8 mm×8 mm的正方形孔洞，讓其緊貼在玻璃蓋玻片上作為P-選擇素吸附的區(qū)域。將130 μL(48-孔板)或102 μL(6-孔板)不同濃度的P-選擇素或125I標(biāo)記的P-選擇素加入到吸附材料中，4 ℃下孵育16 h。將溶液吸出后，用含1%的牛血清白蛋白(BSA)的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)洗3次，再加入1%的BSA HBSS，室溫下孵育1 h。若吸附的是帶標(biāo)記的P-選擇素，此時(shí)用SPECT進(jìn)行放射性檢測。若吸附的不是帶標(biāo)記的P-選擇素，應(yīng)將溶液吸出，再加入125I標(biāo)記的P-選擇素抗體，室溫下孵育30 min。最后將溶液吸出，用1%的BSA HBSS洗3次，加入1%的BSA HBSS防止干燥，用SPECT進(jìn)行放射性檢測。若吸附材料為玻璃時(shí)，SPECT檢測前需先將硅膠墊圈取出，防止結(jié)果受到硅膠吸附的影響。

2.4 SPECT放射性檢測

將樣品放置在GE Infinia Hawkeye 4的檢測平臺上對125I進(jìn)行放射性檢測。標(biāo)記蛋白的層析樣品檢測時(shí)間一般為10 min，位點(diǎn)密度的檢測時(shí)間按實(shí)際樣品的放射量調(diào)整，約20～30 min。樣品檢測完畢后，對每個(gè)樣品孔的放射量用配套軟件進(jìn)行具體分析。

3 結(jié)果

3.1 P-選擇素和P-選擇素抗體分子的標(biāo)記

利用Iodogen法對人類P-選擇素分子及鼠抗人P-選擇素抗體9E1進(jìn)行125I放射性標(biāo)記，之后通過葡聚糖凝膠G-25層析獲得標(biāo)記蛋白洗脫液。圖1(a)和圖2(a)分別為SPECT上顯示的檢測圖像，25管層析洗脫液按順序放置在檢測平臺上，灰度代表放射性，顏色越深即代表放射性越強(qiáng)，每管所對應(yīng)的放射性計(jì)數(shù)如圖1(b)和圖2(b)所示，圖中橫坐標(biāo)為管編號(洗脫順序)。兩種樣品的洗脫都大致呈現(xiàn)了2個(gè)峰，第1個(gè)峰為蛋白峰，大致在3～5號試管間，此后放射性大大減弱，之后又呈現(xiàn)一個(gè)比較寬而平緩的峰，為游離峰。2個(gè)峰之間的分界線比較明顯，說明蛋白和游離125I的分離是比較成功的，標(biāo)記蛋白的純度較高。另一方面，第1個(gè)峰的峰值遠(yuǎn)高于第2個(gè)峰，說明了蛋白的標(biāo)記是比較成功的，大部分的125I已經(jīng)標(biāo)記到目標(biāo)蛋白上，只有少量的125I呈游離狀態(tài)。

圖1 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化125I標(biāo)記P-選擇素

圖2 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化P-選擇素抗體

3.2 P-選擇素分子在玻璃和PS上的吸附

為了對P-選擇素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量，需對收集純化后的標(biāo)記蛋白其進(jìn)行蛋白定量，并計(jì)算出每個(gè)蛋白分子每秒的放射性計(jì)數(shù)。在實(shí)驗(yàn)中，我們收集到125I標(biāo)記的P-選擇素共5 mL，每秒鐘的總放射量計(jì)數(shù)為63.61。利用Pierce BCA蛋白微量定量試劑盒測得其蛋白質(zhì)量濃度為1.003 mg/L，按照P-選擇素/Fc嵌合體分子量為106 kDa進(jìn)行計(jì)算，純化所得的每個(gè)125I標(biāo)記的P-選擇素分子每秒鐘的放射性計(jì)數(shù)為2.23×10-12。

將125I標(biāo)記P-選擇素進(jìn)行梯度稀釋后，分別滴加到面積為8 mm×8 mm的玻璃上，4 ℃下吸附16 h。用含1%的BSA的HBSS清洗3次后在SPECT上進(jìn)行放射性檢測。圖3(a)中顯示的是SPECT檢測20 min后的放射性計(jì)數(shù)圖片，可看到隨著P-選擇素質(zhì)量濃度的增加，125I標(biāo)記P-選擇素的吸附量也隨之增加，放射性計(jì)數(shù)與P-選擇素質(zhì)量濃度之間呈線性關(guān)系(見圖3(b))。在流動腔實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，HL-60細(xì)胞在P-選擇素上進(jìn)行初始拴縛(tether)和stop-go簡單兩步滾動(rolling)的P-選擇素吸附濃度分別為30 μg/L和500 μg/L。根據(jù)P-選擇素溶液濃度與位點(diǎn)密度(見圖3(e))的關(guān)系，可計(jì)算出HL-60細(xì)胞初始黏附的P-選擇素的位點(diǎn)密度為99 sites/μm2，而HL-60細(xì)胞兩步滾動的位點(diǎn)密度則為1 662 sites/μm2。

圖4為測得的P-選擇素分子在PS材質(zhì)上吸附結(jié)果。對應(yīng)于細(xì)胞初始拴縛和滾動黏附的P-選擇素質(zhì)量濃度，其位點(diǎn)密度分別為69 sites/μm2和1140 sites/μm2，二者均低于P-選擇素在玻璃材質(zhì)上的吸附密度。二因素方差分析表明，這種影響十分顯著(P=0.000 3?0.01)，即P-選擇素分子在玻璃上的吸附要優(yōu)于在PS材質(zhì)上的吸附。

3.3 125I標(biāo)記的P-選擇素抗體分子檢測P-選擇素的吸附

已經(jīng)知道P-選擇素與其主要配體PSGL-1結(jié)合的部位位于N-端頭部的lectin結(jié)構(gòu)域上[10]。而在流動腔實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，需要根據(jù)有效的P-選擇素位點(diǎn)密度來對分子反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。由于普通的物理吸附的隨機(jī)性，P-選擇素并非均能呈現(xiàn)易于與其配體分子結(jié)合的朝向，而只有那些頭部結(jié)合位點(diǎn)曝露、能與配體發(fā)生相互作用的分子才是真正需要考察的對象。然而，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果測定的是直接標(biāo)記P-選擇素所得的位點(diǎn)密度，即位點(diǎn)密度當(dāng)中包含了各種朝向的P-選擇素。為了獲得有效P-選擇素的位點(diǎn)密度，我們對P-選擇素胞外區(qū)單克隆抗體9E1進(jìn)行125I標(biāo)記，然后使標(biāo)記抗體與預(yù)先物理黏附在玻璃底板上的P-選擇素結(jié)合，顯然只有結(jié)合位點(diǎn)曝露在外的P-選擇素才能與標(biāo)記抗體結(jié)合，因此，最后測定的是有效P-選擇素的位點(diǎn)密度。

圖3 P-選擇素在玻璃上的吸附結(jié)果

圖4 P-選擇素在PS上的吸附結(jié)果

用Iodogen法對9E1進(jìn)行125I標(biāo)記，收集純化后的標(biāo)記蛋白并對其進(jìn)行蛋白定量。在實(shí)驗(yàn)中，收集到125I標(biāo)記的9E1共6.2 mL，每秒鐘的總放射量計(jì)數(shù)為138.53。利用Pierce BCA蛋白定量試劑盒測得其蛋白濃度為16.625 mg/L，按照IgG分子量為150 kDa進(jìn)行計(jì)算，純化所得的每個(gè)125I標(biāo)記的9E1分子每秒鐘的放射性計(jì)數(shù)為2.07 × 10-12。

將不同濃度(0～1 μg/L)的P-選擇素分別滴加到面積為8 mm×8 mm的玻璃片上，4 ℃下吸附16 h。用含1%的BSA的HBSS洗3次后，加入125I標(biāo)記的單克隆抗體9E1，室溫下孵育30 min。將溶液吸出，再用1%的BSA HBSS洗3次，用SPECT進(jìn)行放射性檢測，結(jié)果見圖5。由圖5(a)(25 min后的放射性計(jì)數(shù)圖片)可知，隨著P-選擇素質(zhì)量濃度的增加，125I-9E1的結(jié)合量也隨之增加，P-選擇素質(zhì)量濃度與放射量、位點(diǎn)密度之間均為線性遞增關(guān)系(見圖5(b)、5(c))。介導(dǎo)HL-60細(xì)胞初始拴縛(30 μg/L)和滾動黏附(500 μg/L)的P-選擇素濃度對應(yīng)的位點(diǎn)密度分別為9 sites/μm2和148 sites/μm2。這2個(gè)值都遠(yuǎn)低于直接標(biāo)記P-選擇素所測得的位點(diǎn)密度(99 sites/μm2和1662 sites/μm2)。已有文獻(xiàn)利用CRD序列的特異性抗體和熒光檢測相結(jié)合的方法對不同吸附方式的P-選擇素位點(diǎn)密度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)密度的結(jié)果與P-選擇素吸附后的分子朝向有密切聯(lián)系[11]。因而，以上測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了通過物理吸附吸附在載玻片上的P-選擇素的方向是隨機(jī)分布的，且頭部位點(diǎn)暴露的P-選擇素只為全部P-選擇素的十分之一左右。

4 結(jié)束語

圖5通過抗體結(jié)合測定P-選擇素在玻璃上吸附結(jié)果

流動腔實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，準(zhǔn)確測定底板上蛋白分子的位點(diǎn)密度是進(jìn)一步通過模型計(jì)算其二維反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的前提和重要保障。例如，通過平行平板流動腔實(shí)驗(yàn)測定HL-60細(xì)胞表面的PSGL-1與流動腔底板P-選擇素之間的正反應(yīng)速率就必須用到分子位點(diǎn)密度的數(shù)據(jù)。

綜上所述，通過125I標(biāo)記與SPECT檢測相結(jié)合的方法測定平面內(nèi)蛋白分子的位點(diǎn)密度是切實(shí)可行的新方法，對比傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)器檢測方法可以更為快速直觀的獲得數(shù)據(jù)，且彌補(bǔ)了其不能測量平面的缺陷。新方法所測量的數(shù)據(jù)能夠與平行平板流動腔實(shí)驗(yàn)相結(jié)合測得二維分子動力學(xué)的一系列參數(shù)，這將會為炎癥、血栓等與細(xì)胞黏附相關(guān)疾病機(jī)理的明晰提供一定的幫助。

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