離子交換色譜法分離氨基酸實驗方法的改進

李 欣，張寶珠，趙玉紅，藺寶珠，李登文，趙立青，張金紅

(南開大學 生命科學學院，天津 300071)

基礎生物化學實驗是南開大學生命科學學院面向本校藥學、醫(yī)學、環(huán)境科學和物理專業(yè)低年級本科生開設的基礎實驗課程。該課程涉及到滴定技術、生物大分子的提取和分離技術等多項生物化學基本實驗技能，每學期54學時，共11個實驗項目，學生人數(shù)150～200人。與生命科學學院本專業(yè)的生物化學實驗課不同的是：學生所學專業(yè)不一、理論基礎和實驗操作能力參差不齊，導致該課程形成時間緊、任務重的特點。

離子交換色譜法是分離和純化生物分子的常用方法之一。由于其應用的重要性和廣泛性，該方法也被引入本科生基礎生物化學實驗“離子交換色譜法分離氨基酸”實驗中。氨基酸分離效果的優(yōu)劣，一方面決定于待分離氨基酸等電點的差異，差異越大，分離效果越好[1-2]；另一方面，樹脂的型號、緩沖液和洗脫液的種類及pH值、洗脫速度等因素都會影響分離效果[3-4]。由于天門冬氨酸(等電點為2.77)和精氨酸(等電點為10.76)的等電點相差較大，本實驗依然沿用之前的實驗選擇，對它們的混合溶液進行分離。所不同的是，在之前的實驗中，采用型號為001×7的離子交換樹脂，NaCl作為洗脫溶液，出現(xiàn)洗脫難，耗時長的現(xiàn)象；而經(jīng)過改進，選用具有“易洗脫”特點的D61樹脂，并將洗脫液改為NaOH，大幅度地改變了氨基酸所處的pH環(huán)境。改進后的實驗方法，不但使洗脫效果得以優(yōu)化，還可以保證學生在規(guī)定時間內完成實驗任務，保障了基礎生物化學實驗課程的進度安排，有利于在本科生實驗教學中普及開展。

1 試劑和器材

試劑：鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、天門冬氨酸、精氨酸、茚三酮、95%乙醇、α-萘酚、堿性次溴酸鈉溶液(把1.2 g溴溶于150 mL、5%的NaOH中)、氯化鈉、氫氧化鈉等。

器材：強酸性離子交換樹脂001×7和D61 (天津南開和成科技有限公司)、內徑為1.9 cm的下閥有導管聯(lián)通的色譜柱、鐵架臺、蠕動泵、分部收集器、廣泛pH試紙、恒溫水浴鍋、分光光度計等。

2 實驗方法

2.1 離子交換樹脂的處理

新樹脂先在蒸餾水中浸泡，洗去雜質和細小顆粒，再用2 mol/L的HCl浸泡4 h左右，除去可能含有的重金屬離子；用蒸餾水洗至中性后，用2 mol/L的NaOH浸泡4 h左右，用蒸餾水洗至中性，樹脂即轉變?yōu)镹a+型。裝柱前，用0.05mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液和樹脂攪拌，達到平衡[5]。

2.2 裝柱

將平衡好的陽離子交換樹脂攪拌后裝柱，使樹脂懸浮液慢慢沉析，直到柱子的1/2左右，此時色譜柱中裝樹脂的高度約為9 cm，樹脂體積約為25 mL。

2.3 加樣

放出過量的緩沖液，當溶液的液面與柱床表面高度相同時，加入氨基酸混合液樣品(天門冬氨酸和精氨酸，10g/L)1 mL，打開蠕動泵(流速0.6 mL/min)，使氨基酸混合液進入樹脂，待液面與柱床表面接近相平時，吸取2～3 mL緩沖液洗滌樹脂柱內壁，并重復2～3次，確保樣品進柱[5]。

2.4 洗脫和收集

首先用0.05 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液以0.6 mL/min的流速洗脫，用試管進行收集，每3 mL收集1管，用茚三酮顯色法進行檢測。當?shù)?種氨基酸被洗脫下來后，將洗脫液換成NaCl或NaOH，流速增加為1 mL/min，同樣是每3 mL收集1管，直到第2種氨基酸被完全洗脫下來。

2.5 氨基酸的檢查

從每支收集管中分別取350 μL收集液放入相應的1.5 mL炮彈管中，用試紙檢測收集液的pH值并調節(jié)，使各管pH為6，再分別加入等體積的0.5%的茚三酮乙醇溶液，混勻后于沸水浴中加熱10 min，如有氨基酸存在，溶液變成藍色[5]。

2.6 精氨酸的檢測

將500 μL收集液與500 μL、20%的NaOH混合，加入2滴α-萘酚，混合后加入1～2滴次溴酸鈉，觀察顏色變化，如果混合液變紅，則說明有精氨酸存在[5]。

3 實驗結果

樹脂在先后兩種不同洗脫液的作用下，使混合氨基酸得以分離。天門冬氨酸是酸性氨基酸，等電點為2.77；精氨酸為堿性氨基酸，等電點為10.76。實驗中首先以0.05 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液作為洗脫液，此時，天門冬氨酸帶負電，無法與陽離子交換樹脂上的Na+進行交換，而此時帶正電的精氨酸卻可以和樹脂結合，因此，在用0.05 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液來洗脫時，天門冬氨酸先被洗脫下來；隨后，換用2 mol/L的NaCl 或1 mol/L的NaOH進行洗脫，使得鹽濃度或pH大幅提高，精氨酸則與樹脂脫離而被洗脫下來[6-11]。

選擇001×7樹脂分離兩種氨基酸，以2 mol/L的NaCl作為洗脫液，洗脫結果如圖1所示。

圖1 001×7樹脂以0.05 mol/L檸檬酸緩沖液和2 mol/L的NaCl為洗脫液的洗脫結果

從圖1中可以看出，兩種氨基酸均被洗脫下來。坂口反應是精氨酸的特征反應，用來檢測精氨酸的存在。第1種被檸檬酸緩沖液洗脫下來的氨基酸坂口反應呈陰性，是天門冬氨酸，被收集在第3至7管中；第2種被2mol/L的NaCl洗脫下來的氨基酸坂口反應成陽性，是精氨酸，被收集在第19至42管中。

選擇D61樹脂分離兩種氨基酸，以1 mol/L的NaOH作為洗脫液，洗脫結果如圖2所示。

圖2 D61樹脂以0.05mol/L檸檬酸緩沖液和1mol/L的NaOH為洗脫液的洗脫結果

從圖2 中可以看出，兩種氨基酸同樣被洗脫下來。第1種被檸檬酸緩沖液洗脫下來的氨基酸坂口反應呈陰性，是天門冬氨酸，被收集在第4至8管中；第2種被1mol/L的NaOH洗脫下來的氨基酸坂口反應成陽性，是精氨酸，被收集在第16至25管中。

比較兩種實驗方法得到的結果，選擇001×7樹脂以2 mol/L的NaCl作為洗脫液，分離得到的精氨酸被集中于24個管中，洗脫不集中，說明此時精氨酸不易被洗脫下來，耗費洗脫液體積較大，時間較長，嚴重影響到該實驗的進度。而選擇D61樹脂以1 mol/L的NaOH作為洗脫液，分離得到的精氨酸被集中于僅僅10管中，洗脫集中，節(jié)省了洗脫液和洗脫時間，取得了良好的洗脫和分離效果，也大大提高了課堂實驗教學效率。

4 討論

(1) 實驗所選用的D61樹脂，是一種大孔的離子交換樹脂，相比001×7樹脂，具有容易洗脫的特點，改善了過去氨基酸分離效果差、難洗脫的現(xiàn)象，且價格便宜，實驗成本低，有利于在實驗教學中廣泛使用。

(2) 實驗中若使用001×7樹脂，需要收集45管左右才能完成實驗，而使用D61樹脂，只需要收集30管左右即可。節(jié)省了實驗時間，保證學生可以在規(guī)定時間內按時完成實驗，保障了教學進度，提高了教學效率，符合基礎生物化學實驗的學時特點。

(3) 本實驗中選擇D61樹脂并用NaOH作為精氨酸的洗脫液，雖然優(yōu)于001×7樹脂用2 mol/L的NaCl洗脫的效果，但也會帶來新的問題。茚三酮反應的最適pH值為5～7，NaOH會使收集液pH大幅升高，影響到茚三酮顯色。因此，在將收集液和茚三酮乙醇溶液混勻前，先要測定收集液的pH值，并將pH值調至6，和0.05 mol/L檸檬酸緩沖液的pH值一致，這樣，既保證了顯色條件和實驗的平行性，同時也加深了學生對于茚三酮反應最適條件的理解。

5 結束語

通過本實驗的改進，學生可以認識到對于離子交換色譜分離氨基酸的效果而言，裝柱和加樣技術的優(yōu)劣、洗脫液的選擇、洗脫速度的改變、pH值等因素都是至關重要的[12]。與此同時，讓學生體會到實驗方法并不是一成不變的，可以通過理論聯(lián)系實際的逐漸摸索將方法不斷優(yōu)化，最終得到滿意的實驗結果。此過程中，不但調動了學生學習的積極性，激發(fā)了學生的學習興趣，還為創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)做出了新的嘗試[13]。

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