Box－Behnken實驗設計法優化丹皮酚－羥丙基－β－環糊精包合物的制備工藝

張冕

(荊楚理工學院化工與藥學院，湖北荊門 448000)

丹皮酚(paeonolum，PAE)是毛茛科植物牡丹的根皮和蘿摩科植物徐長卿全草的主要活性成分，具有鎮靜催眠、解熱鎮痛、抗菌、抗氧化、降血壓等多種藥理活性，臨床上用于治療風濕痛、胃痛、濕疹、過敏性皮炎等，在牙膏、護膚品等日化方面也有應用。PAE為酚類化合物，具有易揮發、水溶性差、見光易分解的特點［1］。羥丙基－β－環糊精(HP－β－CD)是一種良好的藥物載體，較β－環糊精(β－CD)具有水溶性好、毒副作用小、增溶效果顯著的優點。近年來，環糊精包合技術在藥物增溶方面應用廣泛，藥物經包合后，通過改善溶解性能進而提高生物利用度［2］。

Box－Behnken實驗設計法可以提供3到10個因素，進行低、中、高三水平的的二階實驗設計，評價因素和指標間的非線性關系，與國內常采用的正交設計、均勻設計相比，具有精度高、預測性好、簡單、直觀的優點，目前已較多地用于藥物處方篩選、劑型制備過程、生物過程以及化學合成過程的優化［3－5］。

本實驗選取Box－Behnken實驗設計法來進行PAE－HP－β－CD包合物制備工藝的優化設計，以提高PAE的溶解度，并采用相溶解度法、紅外光譜、薄層色譜對包合物進行表征。

1 儀器與材料

梅特勒－托利多電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司);FD－101S集熱式磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);Alpha2－4冷凍干燥機(德國Christ公司);SHZ－82水浴恒溫振蕩器(金壇市國旺實驗儀器廠);Agilent1100高效液相儀(美國Agilent公司);Thermofisher傅立葉紅外光譜儀(賽默飛世爾科技中國有限公司);ZF－1型三用紫外線分析儀(上海顧村電光儀器廠)。

PAE(江西吉安華美香料提煉廠，純度＞99%);PAE對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號: 110708－200506);HP－β－CD(進口分裝，廣州羅蓋特中國有限公司贈送);KBr(光譜純，北京博德恒悅科貿有限公司);甲醇為色譜純;其余試劑及試藥均為分析純。

2 方法與結果

2.1 包合物的制備［2－6］

按一定質量比準確稱取HP－β－CD和PAE，將PAE用適量無水乙醇溶解，將HP－β－CD置于燒杯中，加入適量蒸餾水，30℃水浴加熱攪拌(450 r·min－1)，使其形成飽和溶液。將PAE醇溶液緩慢滴加到包合材料水溶液中，滴加完畢后繼續在同條件反應適當時間。反應完畢，反應液減壓旋轉蒸發回收乙醇，將剩余的水溶液冷凍干燥24 h，即得PAE－HP－β－CD包合物。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱:ZORBA×SB－C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動相:甲醇－水=45∶55;流速:1.0 mL ·min－1;進樣量:20 μL;紫外檢測波長:275 nm;柱溫:室溫。

2.2.2 標準曲線的制備

精密稱定PAE對照品25 mg，加甲醇配制成濃度為1.0 mg·mL－1的儲備液。精密移取上述溶液適量，分別稀釋至10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 μg·mL－1，照“2.2.1”項下條件測定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得其標準曲線方程為y=14698x+7091(r2=0.999 9)，可見PAE在10.0～100.0 μg·mL－1范圍內與峰面積線性關系良好。

2.2.3 方法專屬性考察

照上述色譜條件，分別注入HP－β－CD溶液、PAE對照品溶液和包合物溶液各20 μL進行測定，結果表明雜質峰與藥物峰的分離良好，輔料及試劑不干擾主藥的含量測定，PAE的保留時間約為8.0 min。

2.3 包合率的計算

對包合物的評價一般以包合率為主要指標。將所制備的包合物以蒸餾水溶解后定容，照上述分析方法進行含量測定，按下式計算包合物的包合率:

2.4 包合物制備工藝的優化［3－5］

2.4.1 Box－Behnken實驗設計

在預試驗的基礎上，運用Box－Behnken的中心組合試驗設計原理，以包合率為響應值，選取對包合物影響較為顯著的3個因素進行優化研究，并建立數學模型。實驗中的3個因素分別記作X1，X2和X3，每個因素的低、中、高三水平分別記作－1、0、+1，試驗的各因素水平見表1;利用Design Expert軟件建立的Box－Behnken實驗設計及結果如表2所示。第13～17次試驗為5次重復的中心點試驗，用于考察模型的誤差。

表1 Box－Behnken實驗設計的因素和水平

表2 Box－Behnken實驗設計及響應值(n=3)

續表2

2.4.2 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗

分別采用多元線性和多元二項式數學模型回歸分析因素X1、X2、X3對響應值Y的影響。多元線性模型回歸結果:Y=78.99+3.05X1+1.39X2－1.71X3(R2=0.197 8=0.197 8);多元二項式模型回歸結果:Y=85.36+3.05X1+1.39X2－1.71X3+1.68X1X2－1.98X1X3+4.55X2X3－4.68－6.

對該二項式回歸模型進行方差分析，見表3。由上述方程可知，對于包合物的包合率，二次多項式的擬合度要好于多元線性模型。該模型方程具有極顯著性(P＜0.000 1);校正決定系數0.940 4)，表明大約有94%的包合率變異分布在所研究的3個相關因素中，其總變異度僅有6%不能該模型來解釋;相關系數R為0.986 9(R2=0.973 9)，表明包合率的預測值和實測值之間有很好的擬合度;失擬差不顯著(P＞0.05)，表明方程的擬合不足實驗不顯著，無明顯失擬因素存在，對模型是有利的。因此，該模型可用于對丹皮酚包合物的包合率進行分析和預測。

因素X1、X2、X3對包合效果的線性效應顯著;因素、對包合效果的曲面效應顯著，對包合效果的曲面效應極其顯著;X1X3、X2X3對包合效果的交互影響顯著，X1X2對包合效果的交互影響不顯著。

表3 包合率回歸模型方差分析

續表3

2.4.3 響應曲面分析與優化條件的確定

根據Design－Expert軟件繪制不同影響因素對于響應值的三維曲線圖，見圖1。圖1為分別固定三個影響因素其中之一，考察其他兩個因素對響應值影響的曲面圖，該圖底部平面為等高線圖，等高線圖的重合區域用來進行各影響因素的優化。

根據Box－Behnken實驗設計結果，得到優化條件為:包合時間為67 min，包合溫度為39℃，HP－β－CD與PAE的投料比為3.23∶1(質量比)。為檢驗Box－Behnken實驗設計所得結果的可靠性，根據上述優化條件進行實驗，制備3批樣品分別測定其包合率，理論值為86.7%，實測包合率的平均值為85.3%，相對偏差約0.58%，說明此模型是可靠的。

圖1 各因素對包合率的響應曲面圖

2.5 PAE－HP－β－CD包合物的驗證

按最優包合條件制備PAE－HP－β－CD包合物，對其進行驗證。

2.5.1 相溶解度

相溶解度法可以確證包合物的形成，也是評價包合物溶解性能的最常用的方法。難溶性藥物包合后溶解度增大，通過測定藥物在不同濃度的HP－β－CD溶液中的溶解度，繪制溶解度曲線。可從曲線判斷包合物是否形成，通過計算平衡常數

判斷包合物的穩定性［1，2，6］。

將HP－β－CD加蒸餾水配成濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mmol·L－1的溶液。取上述不同濃度溶液1 mL加入盛有過量PAE的5 mL容量瓶中，25℃條件下于超級恒溫水浴振蕩器中振蕩48 h，使溶液達到平衡后，靜置。取上清液濾過，棄去初濾液，取續濾液經稀釋適當倍數后進行含量測定。參考Higuchi和Connors的方法，以PAE溶解度為縱坐標，HP－β－CD濃度為橫坐標做相溶解度圖，進行線性回歸后計算穩定常數K。

結果表明，隨著HP－β－CD濃度的增加，PAE溶解度呈線性增加，相溶解度曲線為AL型。回歸方程為y=0.4696x+2.7982(R2=0.991 6)，穩定常數K=315.6 L·mol－1，表明二者結合牢固。

2.5.2 紅外光譜分析［6］

取PAE、HP－β－CD、二者的物理混合物(按包合物比例制備)、包合物為樣品，以KBr壓片，在相同的條件下進行紅外光譜掃描，掃描范圍為400～4 000 cm－1，如圖2。

紅外圖譜顯示，物理混合物圖譜表現為PAE圖譜和HP－β－CD圖譜的疊加，包合物圖譜與物理混合物的圖譜、PAE的圖譜相比較有很大區別，與HP－β－CD的圖譜比較類似，其中PAE的特征峰已基本消失，表明PAE已嵌入HP－β－CD的空腔內部形成了包合物。

圖2 紅外光譜圖

2.5.3 薄層色譜分析［7－9］

取包合物100 mg適量于具塞試管中，加石油醚10 mL，超聲處理10 min，靜置，傾出上清液，為石油醚提取液(a)。殘渣加入無水乙醇10 mL，超聲處理10 min，靜置，傾出上清液，此為無水乙醇提取液(b)。再取PAE對照品10 mg，加入無水乙醇溶解10 mL，作為對照品溶液(c)。二者的物理混合物(按包合物比例制備)100 mg加入無水乙醇10 mL，超聲處理10 min，靜置，傾出上清液，為物理混合物樣品(d)。

分別取上述四種溶液10 μL于同一塊硅膠G薄板上點樣，以甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸(12∶4∶0.5)為展開劑，在紫外線分析儀下觀察展開結果，見圖3。樣品a無斑點，樣品b、c、d的斑點清晰可見。PAE易溶于石油醚，而其包合物不溶于石油醚，先用石油醚溶解游離的PAE，再用乙醇破壞包合物提取PAE，結果在石油醚中未見PAE的斑點，而乙醇提取液中有PAE的斑點。進一步表明，PAE被HP－β－CD包合形成了新物相，PAE－HP－β－CD包合物已形成。

圖3 薄層色譜圖

3 討論

1)本實驗采用飽和水溶液法制備PAE－HP－β－CD包合物，嘗試性采用Box－Behnken實驗設計法對制備工藝進行優化，這是一種采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數關系的統計方法，可以評估因素的非線性影響。得到的最佳制備工藝條件為:包合時間67 min，包合溫度39℃，HP－β－CD、PAE投料比為3.23∶1(質量比)。該方法合理、可靠、簡便，能夠較好地預測PAE－HP－β－CD包合物的包合率，可用于制備工藝的優化。

2)對所制得的包合物進行了驗證。包合物的溶解度達到了9.75 mmol·L－1，與純水中PAE的溶解度2.50 mmol·L－1相比提高了約4倍。同時，紅外光譜與薄層色譜的實驗結果均表明PAE嵌入了HP－β－CD的空腔內部，被HP－β－CD包合形成了新物相，包合物已形成。

3)已有許多文獻報道包合物能改善藥物的溶解性與穩定性，對于包合物的釋放性能及相關影響因素有待進一步考察。

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