喹啉酮熒光探針的合成及性能研究*

王會(huì)鎮(zhèn),肖梅杰,張軍慶,肖學(xué)建,楊海君

(西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院//四川省非金屬?gòu)?fù)合與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 綿陽(yáng) 621010)

稀土金屬配合物具有獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)，在發(fā)光材料、結(jié)構(gòu)探針、熒光分析和生物傳感器等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。1979 年，Soini等[1]提出利用稀土熒光螯合物替代放射性同位素作為免疫分析探針，由此開(kāi)創(chuàng)了稀土螯合物作為熒光探針的應(yīng)用領(lǐng)域。若直接用稀土離子來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的話，標(biāo)記率很低，往往需要加入螯合劑，以形成稀土金屬離子的螯合物。稀土離子的熒光，不僅與自身的能級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與配體的性質(zhì)有關(guān)。配體不同，稀土離子的激發(fā)光和發(fā)射光也會(huì)有所不同[2]。通過(guò)設(shè)計(jì)不同結(jié)構(gòu)的螯合劑，即可得到特定性能的稀土熒光探針。楊燕生等設(shè)計(jì)合成了一系列稀土金屬螯合物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了研究，提出了稀土鰲合物熒光探針必備的結(jié)構(gòu)條件[3]。由于烯土熒光探針的特殊性質(zhì)，稀土螯合物作“特效試劑”在生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，合成得到結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單而且性能優(yōu)異的稀土螯合物已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[4-5]。

DNA作為生命遺傳的重要物質(zhì)，自身的熒光效率很低，一般情況下幾乎檢測(cè)不到DNA的熒光，因此常選用熒光分子作為探針來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的特異性識(shí)別和定量分析，這對(duì)基因?qū)W、分析生物學(xué)、病毒學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展具有非常重要的意義[6-7]。目前用于DNA研究的方法有很多種，如熒光光譜法、紫外光譜法和電化學(xué)方法等。具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好及輻射小等優(yōu)點(diǎn)的熒光探針?lè)ň哂袀鹘y(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。已報(bào)道的DNA探針中利用熒光淬滅現(xiàn)象的占多數(shù)，但熒光猝滅的DNA探針在熒光成像等可視化應(yīng)用中價(jià)值不高[8-9]。合成得到更加靈敏且生物相容性好的熒光探針已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。喹啉酮類化合物具有良好的生物相容性，以及較好的熒光性能，因而可將其作為生物相容性熒光探針用于生物檢測(cè)。本文擬合成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的喹啉酮氨三乙酸衍生物，并研究其與DNA相互作用及其稀土金屬鑭螯合的熒光行為。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

間苯二胺(AR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；乙酰乙酸乙酯、乙酸酐、吡啶、氨水、無(wú)水乙醚、鹽酸、乙醇、硝酸鑭、DMSO(AR，成都市科龍化工試劑廠)；氨三乙酸(AR，西隴化工股份有限公司)；鯡魚(yú)精DNA(AR，Sigma 公司)；三羥甲基氨基甲烷(AR，天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心)；Tris (0.05 mol/L)-HCl 緩沖溶液臨時(shí)配制，水為二次蒸餾水。

1.2 儀器

紫外、可見(jiàn)—近紅外分光光度計(jì)UV-3400(島津公司)，熒光分光光度計(jì)LS-55(美國(guó)珀金埃爾默公司)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Varian1200(美國(guó)瓦里安公司)，傅里葉變換紅外光譜儀Spectrum One型(美國(guó)PE儀器公司)，元素分析儀Vario EL CUBE(德國(guó)元素分析系統(tǒng))，600 MHz核磁共振譜儀Bruker Aance600(瑞士布魯克公司)，數(shù)字式電導(dǎo)率儀DDS-11A(上海日島科學(xué)儀器有限公司)，同步熱分析儀SDT Q600(美國(guó)TA儀器公司)。

1.3 試驗(yàn)過(guò)程

1.3.1 4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮(3)的合成[10]將間苯二胺(1.00 g, 9.26 mmol)加入到乙酰乙酸乙酯(1.45 g , 11.2 mmol )中，加熱回流反應(yīng)20 h。自然冷卻至室溫，加入冰水(10 mL)，劇烈攪拌，過(guò)濾析出的沉淀，并用水洗3次。將所得到的固體用甲醇重結(jié)晶3次，得白色晶體，θmp為276～279 ℃，產(chǎn)率75%。4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮(3)的合成反應(yīng)式如下：

1.3.2 化合物5的合成[11]將129 mg氨三乙酸溶于1.75 mL吡啶中，50 ℃下加熱10 min。然后加入0.065 mL醋酸酐，之后在100 ℃下反應(yīng)30 min，待混合物溫度下降到50 ℃時(shí)加入226 mg 4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮，將混合物加熱到100 ℃反應(yīng)1 h。冷卻后減壓蒸餾除去吡啶，然后加入適量氨水將pH值調(diào)為9.5，用無(wú)水乙醚萃取3次。在水相中加入稀鹽酸，調(diào)節(jié)pH為3左右，過(guò)濾析出的白色固體，用乙醇/水(體積比為50∶50 )重結(jié)晶3次，得白色固體，熔點(diǎn)為182～185 ℃，產(chǎn)率20%。化合物5的反應(yīng)式如下：

1.3.3 鑭配合物6的制備 將硝酸鑭(0.433 g，1 mmol)溶于少量的水中備用。將化合物5(0.414 g，1.12 mmol)加到20 mL水中，加入兩滴氨水促進(jìn)溶解。然后將硝酸鑭的水溶液倒入化合物5的水溶液中，立即有白色沉淀生成。加熱回流1 h，旋蒸除去一部分水之后，自然降溫至室溫，然后在8 500 r/min下離心5 min。傾出上清液，白色固體用蒸餾水洗兩次，烘干即得到配合物6。

1.3.4 化合物6的熱分析 樣品用量3.457 0 mg，升溫速率20 K/min，空氣氣氛，空氣流速100 mL/min，實(shí)驗(yàn)溫度范圍為室溫至1 400 ℃。

1.3.5 化合物5與鯡魚(yú)精DNA作用[12]以pH = 7.4的Tris-HCl緩沖液為溶劑，分別配制化合物5的溶液(1.0×10-6mol/L)和DNA的溶液(1.0×10-4mol/L)。在1 cm比色皿中，加入3.00 mL化合物5的溶液，以此溶液為空白參比測(cè)定其熒光光譜(溫度為25 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm，激發(fā)和發(fā)射光譜掃描狹縫寬度均為5.00 nm，激發(fā)電壓為700 V)。然后在該溶液中分次加入一定量的DNA 溶液(每次加入體積為20 μL)，每次加入DNA溶液后均需充分?jǐn)嚢瑁谷芤夯旌暇鶆蚝筮M(jìn)行熒光掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮(3)的合成及表征

圖1 4-甲基-7-氨基-2-喹諾酮(3)的紅外圖譜Fig.1 FTIR spectrum of 7-amino-4-methyl-2-quinoline (3)

2.2 化合物5的合成及表征

通過(guò)氨三乙酸酐與化合物3反應(yīng)來(lái)制備化合物5。在醋酐的作用下先將氨三乙酸轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酸酐，可以大大增加氨三乙酸與化合物3中氨基的反應(yīng)性。為了簡(jiǎn)化該反應(yīng)，直接在合成氨三乙酸酐的溶液體系中加入化合物3進(jìn)行反應(yīng)，不需要對(duì)氨三乙酸酐進(jìn)行分離純化。由于醋酐與氨基反應(yīng)的活性很高，這樣就需要嚴(yán)格控制醋酐的量，保證氨三乙酸轉(zhuǎn)化為酸酐后體系中醋酐剩余量很少。本實(shí)驗(yàn)中加入1 mol的醋酐，與氨三乙酸反應(yīng)完成后體系中的醋酐剩余量很有限，因而可以成功得到目標(biāo)產(chǎn)物5。

圖2 化合物5的IR譜圖Fig.2 FTIR Spectrum of compound 5

圖3 化合物5的ESI-MS譜圖Fig.3 ESI-MS spectrum of compound 5

采用負(fù)離子模式對(duì)化合物5進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，所得質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。計(jì)算目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為347，圖譜中的345.9為化合物5的準(zhǔn)分子離子峰[M-1]。元素分析測(cè)定化合物5的C、H、N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為55.30%、4.96%和12.15%，與計(jì)算值55.33%、4.93%、12.10%相當(dāng)吻合。

化合物5的1H NMR (DMSO, 600 MHz)核磁如圖4所示。δ12.63 (br s, 2H)為羧基的OH氫，11.55 (s, 1H)為喹啉酮母體的1-NH，10.49 (s, 1H)為喹啉酮的7-NH。7.90 (d, 1H)、7.65 (d, 1H)和7.25 (dd, 1H)為喹啉酮的芳環(huán)氫，6.26 (s, 1H)為喹啉酮的3-H。3.58 (s, 4H)和3.53 (s, 2H)為氨三乙酸片段的3個(gè)亞甲基氫。2.39 (s, 3H)為喹啉酮的4-Me氫。

圖4 化合物5的核磁氫譜Fig.4 1H NMR spectrum of compound 5

綜合IR、ESI-MS、1H NMR和元素分析數(shù)據(jù)表明所合成的化合物5為4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮的氨三乙酸酰胺衍生物。

2.3 鑭配合物6的合成與表征

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，所合成的配體化合物5在水中的溶解性較差。加入少量氨水后，將其轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的銨鹽，可以大大增加其水溶性。在化合物5的水溶液中加入硝酸鑭水溶液后，立即出現(xiàn)大量的白色固體，表明金屬鑭已經(jīng)與化合物5發(fā)生了配位作用，并且所生成的金屬鑭配合物6的水溶性較差。

圖5 配合物6的IR譜圖Fig.5 FTIR spectrum of complex 6

理論上，配合物6應(yīng)該是化合物5與金屬La按1∶1的配合物，相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算值為546.0。采用正離子模式對(duì)配合物6進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，所得質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6。圖譜中的569.2為配合物6與一個(gè)鈉離子結(jié)合后的準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]+，證明配合物6確實(shí)是化合物5與金屬La 1∶1的配合物，分子式為L(zhǎng)a(C16H15N3O6)NO3。

在氧氣氛圍下，對(duì)配合物6進(jìn)行熱分析，得到配合物6的TG-DTG曲線(圖7)。配合物6受熱后表現(xiàn)為四段不連續(xù)的失重，整體失重率為72.61%。前兩段失重溫度在200 ℃以內(nèi)，為配合物6中水分子的失去，失重率為11.49%，經(jīng)計(jì)算可知配合物6分子中約含有4個(gè)水分子。第一段失重的溫度在130 ℃以內(nèi)，失重率約為8.63%，可判斷失去的是3個(gè)結(jié)晶水，而不是配位水。第二段失重溫度在130～200 ℃，失重率2.86%，判斷為配合物6中失去了1個(gè)配位水分子[15]。第三段失重發(fā)生在200～380 ℃，失重率為27.65%，可能是配合物6分子中不穩(wěn)定的羧基等含氧官能團(tuán)的分解。第四步失重發(fā)生在380～720 ℃，可能是配體6骨架的分解和氧化等[16]。溫度升高至720 ℃后，殘余質(zhì)量無(wú)明顯變化，殘留物為L(zhǎng)a2O3，殘余質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為27.39%，與計(jì)算值26.59%基本一致。從以上分析結(jié)果可知，配合物6的分子式為[La(C16H15N3O6)NO3]·4H2O。元素分析測(cè)定配合物6的C、H、N、O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30.71%、3.86%、9.12%和33.86%，與計(jì)算值31.13%、3.59%、9.08%、33.70%，相當(dāng)吻合。

圖7 配合物6的TG-DTG曲線Fig.7 TG-DTG curves of complex 6

圖8 配合物6的結(jié)構(gòu)式Fig.8 Molecular structure of complex 6

2.4 化合物5與鑭配合物6的熒光譜圖分析

由圖9可以看出在激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm下，化合物5與鑭絡(luò)合后熒光性能有明顯的變化。化合物5的最大發(fā)射波長(zhǎng)為374 nm，發(fā)射強(qiáng)度為290。當(dāng)與鑭形成配合物后，最大發(fā)射波長(zhǎng)變?yōu)?20 nm，發(fā)射強(qiáng)度為1 210，是化合物5的4.17倍，且呈現(xiàn)出更好的峰形。化合物5與鑭配合物6的熒光波長(zhǎng)均比激發(fā)波長(zhǎng)，這正是Stokes熒光的特點(diǎn)[18]。化合物5分子中含有共軛體系，受到激發(fā)光照射時(shí)可發(fā)生電子躍遷，進(jìn)而產(chǎn)生熒光現(xiàn)象(圖9)。當(dāng)化合物5與鑭形成配合物后，配體的最低三重態(tài)能級(jí)與稀土離子激發(fā)態(tài)能級(jí)可以較好的匹配。化合物5吸收激發(fā)光能量后，會(huì)以非輻射的方式將能量傳遞給金屬鑭陽(yáng)離子，從而間接地激發(fā)金屬鑭陽(yáng)離子產(chǎn)生熒光[2,19]。鑭配合物6的熒光性能優(yōu)良，在生物檢測(cè)以及光物理和光電化學(xué)等領(lǐng)域具有的潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖9 化合物5(1.0×10-6 mol/L)與鑭配合物6(1.0×10-6 mol/L)的熒光譜圖Fig.9 Fluorescence spectra of compound 5 and La-complex 6

2.5 化合物5與鯡魚(yú)精DNA的相互作用研究

以化合物5的緩沖溶液(Tris(0.05 mol/L)-HCl)作為空白溶液，熒光掃描得到圖10的曲線1。曲線2至6分別為在3 mL的空白溶液中逐次滴加20 μL的DNA緩沖溶液(1.0×10-4mol/L)后的熒光變化情況。曲線2至6中DNA的濃度分別為0.67×10-6、1.34×10-6、2.01×10-6、2.68×10-6、3.35×10-6和4.02×10-6mol/L。據(jù)此圖可知，在25 ℃，pH = 7.4的環(huán)境里，隨著DNA緩沖溶液的加入，體系的熒光逐漸加強(qiáng)，表明DNA與化合物5之間有較強(qiáng)的相互作用，且DNA對(duì)化合物5具有熒光增強(qiáng)作用。當(dāng)體系中的DNA濃度達(dá)到4.02×10-6mol/L后，體系的熒光強(qiáng)度不再隨著DNA濃度的增加而明顯增強(qiáng)。加入DNA分子后，化合物5較大的疏水平面插入到DNA螺旋堿基對(duì)中，發(fā)生π-π堆砌作用，得到比化合物5更大的共軛結(jié)構(gòu)，從而獲得更高的熒光強(qiáng)度。此外，在DNA加入前，化合物5在水溶液中因被水分子包圍，熒光較弱，當(dāng)化合物5以插入作用模式進(jìn)入到DNA的疏水區(qū)域時(shí)，減小了水分子對(duì)其的碰撞，化合物5分子本身的熱振動(dòng)減少，能量可更高效率的轉(zhuǎn)化為熒光發(fā)射，使化合物5熒光強(qiáng)度增加，即產(chǎn)生增色效應(yīng)[20-21]。圖中顯示熒光強(qiáng)度與DNA濃度的關(guān)系呈正相關(guān)，可將該化合物用于DNA的定量檢測(cè)等。

圖10 鯡魚(yú)精DNA存在時(shí)化合物5熒光譜圖Fig.10 Fluorescence spectra of compoumd 5(1.0×10-6 mol/L) in the presence of herring DNA

2.6 DNA濃度與化合物5熒光強(qiáng)度的關(guān)系

圖11中橫坐標(biāo)為溶液中的DNA濃度，縱坐標(biāo)為最大熒光發(fā)射強(qiáng)度(測(cè)試條件為25 ℃，pH 7.4)。此環(huán)境下化合物5對(duì)DNA的響應(yīng)非常迅速，2 min內(nèi)即可達(dá)到平衡，且在25 ℃避光條件下，相對(duì)熒光強(qiáng)度可保持7 h不變。由圖可知，在0～4.02×10-6mol/L濃度區(qū)間內(nèi)，熒光發(fā)射強(qiáng)度與DNA濃度呈線性相關(guān)，可用于DNA的定量檢測(cè)等。以10%的熒光增強(qiáng)計(jì)算，化合物5對(duì)DNA濃度的檢測(cè)限可低至5×10-7mol/L。

圖11 DNA濃度對(duì)化合物5熒光強(qiáng)度的影響Fig.11 Influence of DNA concentration on the fluorescence intensity of compound 5

3 結(jié) 論

以間苯二胺和乙酰乙酸乙酯為原料，成功合成得到了新的喹啉酮類熒光化合物5以及化合物5與金屬鑭的配合物6。配合物6與未配位的化合物5相比，熒光波長(zhǎng)紅移至420 nm，且呈現(xiàn)出更好的峰形，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，是配體化合物5熒光強(qiáng)度的4.17倍。由于其優(yōu)良的熒光性能，配合物6在生物檢測(cè)及光電化學(xué)等領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。化合物5與DNA相互作用研究表明，化合物5與DNA有很強(qiáng)的相互作用，DNA對(duì)化合物5有熒光增強(qiáng)作用。化合物5的熒光強(qiáng)度與DNA的濃度在0～4.02×10-6mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可將其用于DNA的定量檢測(cè)等。

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