復方血栓通膠囊基于原料藥材與藥效相關聯的組方規律研究*

劉 宏，謝稱石，王永剛，李沛波，彭 維，龍超峰，蘇薇薇

(1.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275；2. 廣東眾生藥業股份有限公司，廣東 東莞 523325)

復方血栓通膠囊系廣東眾生藥業股份有限公司的拳頭產品，于2001年被列為國家中藥保護品種。復方血栓通膠囊由三七、黃芪、丹參、玄參四味藥材組成，用于治療血瘀兼氣陰兩虛證的視網膜靜脈阻塞和穩定性勞累型心絞痛，臨床療效顯著[1-4]。

中藥復方的特色在于：通過多味藥材的相互配合，實現對機體失衡狀態的修正。然而，由于東西方文化的差異，對于中藥復雜體系來說，傳統的“君臣佐使”理論，尚未被西方醫學界接受。目前，通過藥效實驗科學解釋“君臣佐使”規律，尚處于發軔階段。本研究基于灰色關聯分析方法，研究復方血栓通膠囊組方中各味藥材與藥效間的關聯性，科學解釋其組方配伍規律，以祈在中西醫之間架起溝通的橋梁，具有理論意義和實用價值。

1 材 料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，130只，體質量180～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK-(粵)2008-0002。

1.2 實驗藥品與試劑

藥效實驗：復方血栓通差異樣品浸膏(批號：120523)，由廣東眾生藥業股份有限公司提供，用生理鹽水分別配制成152 mg/mL的藥液；w=0.1%鹽酸腎上腺素注射液，規格1 mg：1 mL，上海禾豐制藥有限公司，國藥準字H31021062，批號：20111109、20120315，用生理鹽水稀釋至0.4 mg/mL，現用現配；阿司匹林(Asp)腸溶片，吉林市鹿王制藥公司，國藥準字H22025784，批號：BTA7WH2；復方丹參滴丸(Fdd)，天津天士力制藥股份有限公司，國藥準字Z10950111，批號：120201；氯化鈉注射液(w=0.9%)，廣東利泰制藥股份有限公司，批號：11100852、廣東科倫藥業有限公司，批號：D12070311-2；二水合檸檬酸三鈉，廣州化學試劑廠，批號：20030904-1；水合氯醛(水合三氯乙醛)，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20111114。

色譜部分：液相色譜所用試劑乙腈(Burdick & Jackson, Honeywell)、磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)為色譜純，水為超純水，其余所用試劑為分析純。

1.3 實驗儀器

藥效實驗：渦旋振蕩器：Scientific Industries Vortex-Genie 2；十萬分之一電子天平：Sartorius BP211D、ACCμLAB ALC-210.4；超低溫冰箱：海爾 BCD-568W；冷凍離心機：Eppendorf 5430R、TD5A-WS、TDL-5M；北京普利生LBY-NJ4血小板聚集儀；Sysmex CA-510全自動血凝分析儀；北京普利生LBY-N6B全自動自清洗血流變儀；北京普利生LBY-XC40全自動動態血沉測試儀。

色譜部分：Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀(美國Dionex公司，DGP-3600SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機、WPS-3000SL自動進樣器、TCC3000-RS柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon6.8數據處理軟件)；十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司，BP211D型)；超純水器(美國密理博Millipore公司，Simplicity)；旋轉蒸發儀(德國Laborota公司，4001型)；數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，KQ-250DE型)；燒杯、錐形瓶、茄形瓶、滴管、移液管等玻璃儀器。色譜柱型號：Dionex Acclaim?120 C18(3 μm，150 mm×4.6 mm)。

1.4 實驗環境

經中山大學生命科學學院動物倫理委員會批準飼養于廣東省中山大學海洋與中藥實驗室SPF級動物房，許可證號： SCXK-(粵)2009-0020。觀察室溫度20～23 ℃，相對濕度50%～65%，顆粒飼料，在實驗動物適應新環境一周后開始實驗并實驗過程中采取適當的方法減輕對動物的傷害。

2 方 法

2.1 差異樣品的構建及指紋圖譜分析

1) 差異樣品的制備：根據復方血栓通膠囊的處方組成，按照配方約束下四因素九水平的均勻設計[5]，調整4味藥材的配比，在此基礎上制備了9個差異樣品[6]。

2) 差異樣品指紋圖譜分析及聚類分析：分別取復方血栓通差異樣品1-9號約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中加φ=70%的甲醇20 mL，密塞，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz) 30 min，濾過，將濾紙及殘渣置同一錐形瓶中，再加入甲醇20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz) 30 min，濾過，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至近干，加φ=50%甲醇使溶解，定量轉移至10 mL量瓶，加φ=50%甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得差異樣品供試品溶液。采用指紋圖譜的構建方法[7-10]，對制備所得差異樣品1-9號進行HPLC分析，并根據差異樣品指紋圖譜中21個已確證成分的共有峰峰面積，將其導入SPSS 18.0 中進行聚類分析，聚類方法采用Between-groups linkage，距離計算方法采用Pearson correlation。

2.2 差異樣品藥效學實驗

1) 實驗分組及給藥：SD大鼠130只隨機分為13組，分別為空白對照組，急性血瘀模型組，陽性對照Asp給藥組，陽性對照Fdd給藥組,復方血栓通差異樣品1-9組。陽性對照組Asp 100 mg/kg/d，陽性對照組Fdd 800 mg/(kg·d)-1,復方血栓通差異樣品1-9組1520 mg/(kg·d)-1。實驗動物在飼養環境中適應一周后開始給藥，每天灌胃給藥一次，給藥體積均為10 mL/kg，空白對照組與模型組灌胃給予同體積生理鹽水，連續給藥10 d。

2) 大鼠急性血瘀模型：末次給藥后30 min，除空白對照組外其余各組大鼠均皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg，空白組大鼠皮下注射等量生理鹽水，過2 h 后除空白對照組外其余各組大鼠均浸入0～4 ℃ 冰水內進行冷刺激5 min，2 h 后再次皮下注射等量鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg[11-14]，處置后禁食12 h后各組進行灌胃給藥，1 h后每100 g體質量腹腔注射麻醉φ=10%水合氯醛0.35 mL，腹主動脈采血，枸櫞酸鈉1:9抗凝，血樣處理及檢測全部按照標準操作規程進行，所取血液全部用于血液流變和凝血功能相關藥效指標檢測[15-16]。

3) 大鼠血液藥效指標檢測：取1.5 mL抗凝血液放入TDL-5M冷凍離心機進行離心(2 000 r/min, 15 min, 20 ℃)得血漿，一部分血漿放入Sysmex CA-510全自動血凝分析儀進行活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)項目檢測，一部分血漿放入北京普利生LBY-N6B全自動自清洗血流變儀進行毛細管血漿黏度(PV)檢測；取0.9 mL抗凝血液放入北京普利生LBY-N6B全自動自清洗血流變儀進行全血黏度(WBV, 150 s-1)、紅細胞聚集指數(EAI)及紅細胞電泳指數(RCEI)檢測；取0.9 mL抗凝血液放入TDL-5M冷凍離心機進行離心(2 000 r/min, 15 min, 20 ℃)并放入北京普利生LBY-XC40全自動動態血沉測試儀進行紅細胞壓積檢測；取3.0 mL抗凝血液放入TDL-5M冷凍離心機進行第一次離心(500 r/min, 20 ℃, 10 min)得富血小板血漿(PRP)，取出富血小板血漿并將剩余部分再次離心(3 000 r/min, 20 ℃, 10 min)得貧血小板血漿(PPP)，5 μL ADP(300 μmol/L)用于誘導血小板聚集，300 μL PRP與300 μL PPP放入北京普利生LBY-NJ4血小板聚集儀檢測血小板最大聚集率(MPAR)。

2.3 灰色關聯分析[17-19]

在本研究中，各處理組藥效指標的均值用以表征藥效高低，為方便各種分析方法的計算，在進行藥材含量-藥效關聯分析之前先對藥效作用原始數據中的負向指標先做正向化處理(取倒數)再用均值化方法進行無量綱化處理[20]。除了空白組外所有組動物都進行了造模處理，只受給藥單一因素的影響。為直觀顯示Asp、Fdd及9組差異樣品的藥效強弱，定義模型組的7個藥效指標值為參考數列，其余Asp組、Fdd組及差異樣品1-9組為比較數列，利用灰色關聯分析方法計算比較數列與參考數列的灰色關聯度，灰色關聯度越高則認為與模型組相似度越高，則整體藥效越差。

3 結 果

3.1 差異樣品指紋圖譜分析及聚類分析

對差異樣品的指紋圖譜(圖1 A、B)進行聚類分析，結果見圖1(C)。當聚類重新標定距離(Rescaled Distance Cluster Combine)為5 時，9 批樣品可分為七類：2、3為一類，7、8為一類，其余自成一類。

圖1 復方血栓通膠囊差異樣品HPLC圖譜(A：203 nm；B：270 nm)及聚類分析結果(C) Fig.1 The HPLC fingerprint (A：203 nm；B：270 nm)and cluster analysis of samples

3.2 差異樣品藥效實驗

1) WBV(150 s-1)

實驗結果表明：急性血瘀大鼠高切變率下WBV顯著升高(P<0.05)，而Asp、Fdd、差異樣品1、2、3、4、5組對大鼠WBV升高有顯著抑制作用(P<0.05，P<0.01)，其余各組與模型組比較無統計學差異(圖2)。

圖2 差異樣品對150 s-1切變率下全血黏度的改善作用柱狀圖Fig.2 The effects of samples on WBV at 150 s-1

2) EAI、RCEI

實驗結果表明，急性血瘀大鼠EAI顯著升高(P<0.01)，RCEI顯著降低(P<0.01)；而Asp、Fdd、差異樣品1、2、3、4、5、6、8組對EAI升高均有顯著抑制作用(P<0.05)，差異樣品2、4、5對RCEI的降低有顯著改善作用(P<0.05)，其余各組與模型組比較無統計學差異(圖3)。

圖3 差異樣品對紅細胞聚集、電泳指數的改善作用柱狀圖Fig.3 The effects of samples on EAI and RCEI

3) PT、APTT

實驗結果表明，急性血瘀大鼠PT顯著降低(P<0.01)、APTT顯著降低(P<0.05)，而各給藥組中只有差異樣品3組對APTT的降低有顯著抑制作用(P<0.05)，其余各組除了差異樣品7組外對PT、APTT均有一定的提升作用，但與模型組比較無顯著性差異(圖4、圖5)。

圖4 差異樣品對PT的改善作用柱狀圖Fig.4 The effects of samples on PT

圖5 差異樣品對APTT的改善作用柱狀圖Fig.5 The effects of samples on APTT

4) MPAR、PV

實驗結果表明，急性血瘀大鼠PV 及MPAR均顯著升高 (P<0.01)，而Asp、差異樣品1、5組對MPAR的升高有顯著抑制作用(P<0.01)，其余各組則均有一定的改善作用，Asp、Fdd、差異樣品各組對PV 的改善作用較弱，與模型組比較無統計學差異(圖6、圖7)。

圖6 差異樣品對血小板最大聚集率的影響柱狀圖Fig.6 The effects of samples on MPAR

圖7 差異樣品對血漿黏度的影響柱狀圖Fig.7 The effects of samples on PV

3.3 灰色關聯分析

差異樣品藥效比較的灰色關聯分析結果見表1。在驗證了復方血栓通差異樣品間具有藥效差異后，進一步考察三七、黃芪、玄參、丹參4味藥材對藥效的貢獻大小。以4味藥材在差異樣品中的含量為參考數列，以每個藥效指標值在差異樣品中的大小為比較數列，利用灰色關聯分析方法計算比較數列與參考數列的灰色關聯度，關聯度越高則表明該藥材藥效貢獻越大，計算結果見表2。在明確了四味藥材的藥效貢獻大小后，對每味藥材與7個藥效指標的關聯度進行排序，從而進一步分析各味藥材的主要藥效作用靶點，計算結果見表3。

表1 復方血栓通差異樣品各組與模型組灰色關聯度(由左至右依次降低)Table 1 The grey relational degree of samples

表2 四味藥材與7個指標灰色關聯度Table 2 The grey relational degree between herbs and efficacy indicators

表3 四味藥材與7個藥效指標灰色關聯度排序結果(從上至下遞減)Table 3 The grey relational degree ranling results efficacy indicators towards herbs

4 討 論

Asp為世界公認的有效抑制血小板聚集的藥物，可有效緩解血液高凝狀態，有證據顯示Asp可減少心肌梗死、中風和血管性死亡的風險[21-22]。Fdd可顯著改善血液循環障礙，臨床上常用于治療冠心病、心絞痛[23]。本研究中，作為陽性藥物，Asp和Fdd分別顯示了較好的活血化瘀療效，其中Asp可顯著改善全血黏度及血小板聚集率，Fdd可顯著改善全血黏度及紅細胞聚集性，表明本實驗藥效模型適用于活血化瘀藥物的篩選。

由于4味藥材配比的不同，9個復方血栓通差異樣品的藥效顯示出明顯的差異。由表1可知，藥效作用強弱順序由大到小為S5>S1>S2>S4>S3>S8>S9>S6>S7，即5號差異樣品藥效作用最強，6-9號樣品藥效較差。

從表2可知，三七藥材與所有藥效指標間的關聯度均在0.8左右，其余三味藥材的關聯度則在0.6左右，三七對藥效的貢獻要遠遠高于其余三味藥材，從而表明三七為組方中主要藥效貢獻者，是活血化瘀之要藥。

藥材與藥效指標間關聯度的排序能夠直觀顯示藥材主要作用于哪些藥效指標，結合其臨床意義則可揭示4味藥材間的相互協調作用。表3提示，三七與PV、PT、APTT、高切變率下WBV及血小板聚集率關聯密切，表明三七可能對血液中紅細胞變形性、血小板、血漿蛋白及凝血因子具有調節作用，其余三味藥材均主要與EAI關聯較大，表明三味藥材可能對血液中紅細胞聚集性具有抑制作用，從而可有效抑制全血黏度的升高。

紅細胞呈雙凹圓盤形狀，直徑約7～8 μm，它可以通過比自己直徑要小甚至小好幾倍的微血管，這一特性對微循環具有重大意義。紅細胞具有明顯的變形能力及很好的彈性，若這種能力喪失，紅細胞無法通過微小的毛細血管，極易導致微循環障礙，血液堵塞，黏度增高。高切變率下全血黏度表征血液中紅細胞變形性的強弱[24]，三七可顯著降低高切變率下的全血黏度表明其對紅細胞變形性具有很好的調節作用，從而可以增強微小血管的血液流動性，改善微循環。由此可見三七作為復方血栓通膠囊藥效的主要貢獻者，對其適應癥之一視網膜眼底靜脈栓塞、眼底瘀血有著舉足輕重的作用。

PT表征外源性凝血系統功能，是監測口服抗凝劑的常用指標，APTT是內源性凝血系統較為簡便、敏感的篩選試驗。二者均與血液中凝血因子息息相關[25]。血小板功能的正常是血液通暢的必要條件之一，血小板聚集率升高是心血管疾病的重要致病因素之一[26]。血漿黏度的升高是由血液中大分子血漿蛋白紊亂引起，可引發血液產生高凝狀態。凝血因子、血小板、血漿蛋白等是血液系統中的重要組成部分，三七與PV 、PT、APTT及血小板聚集率關聯密切，可推測三七在改善微循環的同時可在一定程度上修復血液系統，對非細胞結構成分具有一定的調節作用。

有證據顯示缺血性心臟病、心肌梗塞患者其紅細胞聚集性顯著增高。紅細胞聚集程度增加，促使血液黏度增加，同時還可能引發其他血流變指標改變，導致血液阻力增大，血液流動性減弱，甚至使某些毛細血管、微小靜脈堵塞，導致循環血液灌注量不足，組織或器官缺血、缺氧及酸性代謝產物增加，后果十分嚴重。紅細胞聚集指數可表征血液中紅細胞聚集性的強弱[24]。黃芪、丹參、玄參三味藥材均與該藥效指標密切相關，表明三味藥材可顯著降低紅細胞聚集性，降低血液黏度，調節全身組織的血液流動性。由此可知復方血栓通膠囊中三味藥材可增強三七對血液微循環障礙的改善作用，對其適應癥之一血瘀兼氣陰兩虛的穩定性勞累型心絞痛發揮較好的療效。

綜合上述分析，三七可顯著改善微循環障礙，調節凝血功能，緩解毛細血管及微小靜脈堵塞；黃芪、丹參、玄參三味藥材可顯著降低血液中紅細胞間的聚集性，從而使血液運行順暢，防止血液高凝狀態出現。四味藥材藥效作用各有優勢又相互補充，合理發揮了多靶點、多途徑調控的作用。

傳統中醫理論認為，三七活血化瘀為君藥，丹參為臣藥，破瘀血、補新生血，加強君藥之活血化瘀，黃芪之大補元氣與玄參之滋陰合用治療氣陰兩虛為佐藥。本研究結果與傳統中醫理論不謀而合，以創新的思路與方法解釋了復方血栓通膠囊組方配伍規律，為其他中藥復方配伍研究提供了范例。

[1] 劉忠政,梁潔萍,聶怡初,等. 復方血栓通膠囊基于血液循環和凝血過程相關靶點的網絡藥理學研究[J]. 中山大學學報:自然科學版, 2013, 52(2): 97-100.

[2] 何善智. 復方血栓通膠囊的藥理研究[J]. 廣東醫學, 1997, 18(1): Ⅱ.

[3] 邢玉微. 復方血栓通膠囊對糖尿病大鼠微血管保護作用及機制探討[D]. 上海: 第二軍醫大學, 2010.

[4] 張建浩,黃緒亮,黃海波,等. 復方血栓通滴丸對血瘀大鼠血液流變學及小鼠凝血時間的影響[J]. 中國藥學雜志, 2000, 39(5): 350-352.

[5] 方開泰. 均勻設計與均勻設計表[M]. 北京: 科學出版社, 1994.

[6] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部) [S].北京:中國醫藥科技出版社,2010: 909-910．

[7] 梁潔萍,劉忠政,彭維,等. 復方血栓通膠囊HPLC指紋圖譜質量控制方法研究[J]. 中藥材, 2012, 35(11), 1854-1858.

[8] 關倩怡,黃琳,彭維,等. 口炎清顆粒指紋圖譜研究[J]. 中山大學學報:自然科學版, 2011, 50(1): 115-118.

[9] 鄭文燕,王曉東,彭維,等. 祛痰止咳顆粒指紋圖譜研究[J]. 中山大學學報:自然科學版, 2011, 50(3): 98-101.

[10] 梁潔萍,陳思,謝稱石,等. 復方血栓通膠囊中4個有效成分的一測多評定量方法研究[J]. 中山大學學報:自然科學版, 2013,52(5): 123-126

[11] 陳奇. 中藥藥理研究方法學[M]. 北京: 人民衛生出版社, 1993: 564.

[12] 紀文巖,劉英慧,高曉昕. 腎上腺素合冷刺激致血瘀模型大鼠血栓形成標志物變化的實驗研究[J]. 世界中西醫結合雜志, 2010, 5(9): 758-759.

[13] 李偉霞,黃美艷,唐于平,等. 大鼠急性血瘀模型造模方法的研究與評價[J]. 中國藥理學通報, 2011, 27(12): 1761-1765.

[14] LIU L, DUAN J A, TANG Y, et al. Taoren-Honghua herb pair and its main components promoting blood circμlation through influencing on hemorheology, plasma coagμlation and platelet aggregation[J]. J Ethnopharmacol, 2012, 139(2): 381-387.

[15] 曹明山,張道華. 血液流變學檢查的臨床應用及注意事項[J]. 臨床醫藥實踐, 2003,12(6):474.

[16] 李鳳蘭,程虎英,劉瑩. 血液流變學標本采集的注意事項[J]. 全科護理, 2009, 7(2): 328.

[17] 蘇薇薇. 嶺南特色中藥指紋圖譜質量控制關鍵技術研究[M]. 廣州：廣東科技出版社, 2012: 327-340.

[18] SONG Q, SHEPPERD M. Predicting software project effort: A grey relational analysis based method[J]. Expert Systems with Applications，2011, 38(6)：7302-7316.

[19] KUO Y, YANG T, HUANG G W.The use of grey relational analysis in solving mμltiple attribute decision-making problems[J].Computers & Industrial Engineering, 2008, 55(1)：80-93.

[20] 劉新華. 因子分析中數據正向化處理的必要性及其軟件實現[J]. 重慶工學院學報：自然科學版, 2009, 23(9): 152-155.

[21] HENNEKENS C H, BURING J E. Aspirin in the primary prevention of cardiovascular disease[J]. Cardiology Clinics, 1994, 12(3): 443-450.

[22] MAREE A O, CURTIN R J, DOOLEY M, et al. Platelet response to low-dose enteric-coated aspirin in patients with stable cardiovascμlar disease[J]. Journal of the American College of Cardiology， 2005, 46(7)：1258-1263.

[23] JIANG S M, FU Y, CHEN Y P, et al. Study on protective effects of traditional Chinese medical complex prescription on myocardial ischemia/reperfusion injury after coronary artery ligation in rats[J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine in Intensive and Critical Care, 2005, 12(6):347-351.

[24] WEN Z, YAO W, XIE L, et al.Influence of neuraminidase on the characteristics of microrheology of red blood cells[J]. Clinical Hemorheology and Microcircμlation,2000, 23(1):51-57.

[25] BAJAJ S P, JOIST J H. Seminars in thrombosis and hemostasis[M].New York: Stratton Intercontinental Medical Book Corporation, c1974-1999: 407-418.

[26] GACHET C, CAZENAVE J. ADP induced blood platelet activation: a review[J]. Nouvelle Revue Francaise Dhématologie, 1991, 33(5): 347.