小麥GLB1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定*

孔令超，楊成彬，詹政科，劉志強，劉立忠，劉志剛，朱清仙

(1. 深圳大學醫學院過敏反應與免疫學研究所，廣東 深圳 518060；2.南昌大學研究生院醫學部2011級，江西 南昌330006；3.深圳大學醫學院血液循環教研室，廣東 深圳 518060；4. 南昌大學醫學院組胚教研室，江西 南昌330006)

I型糖尿病(T1D)又稱胰島素依賴型糖尿病(Insulin- dependent Diabetes Mellitus,IDDM)，是一種器官特異性自身免疫疾病，該類病人由于機體胰島素絕對缺乏而需終身依賴外源胰島素來維持機體血糖的平衡。I型糖尿病主要發生在青少年，占糖尿病患者的5%～10%[1-2]。過去50年中全球I型糖尿病發病率增長了2～4倍，0-14歲兒童發病率每年以3%的速率增長[3-6]。I型糖尿病患者不僅有多尿、多食、多飲、消瘦等糖尿病的典型癥狀，還會繼發出現糖尿病酮癥酸中毒，晚期還因微血管病變導致視網膜病變及腎功能損害。由此可見I型糖尿病嚴重危害患者的健康和生活質量，同時也給患者、家庭、社會造成巨大的經濟負擔。I型糖尿病是由T淋巴細胞介導，通過對胰島的浸潤、引發胰島炎癥，破壞及降低胰島β細胞分泌胰島素的能力,導致胰島素絕對缺乏[7]。絕大多數I型糖尿病是在易感基因的基礎上，由一個或多個環境因素誘導引起。

研究發現食物是與I型糖尿病發病最為密切的環境因素[1]。對糖尿病易感大鼠(BB大鼠)的研究揭示，食物可誘導糖尿病的發生和發展[8-11]。有研究證明小麥麩質是最強的致糖尿病的食物因素[12-15]。以小麥為主食的NOD小鼠的糖尿病的發病率明顯高于飼養不含小麥麩質的對照組小鼠[16-17]，越來越多的研究提示小麥蛋白在人的I型糖尿病發生和病理過程中起重要作用[18-19]。最近的研究進一步表明小麥麩質所含的Glb 1在其致糖尿病的發生中起到了重要的作用。Scott實驗室利用易感BB大鼠IgG抗體從小麥cDNA表達文庫中篩選出小麥儲藏蛋白(Glb 1)[20]。抗Glb 1抗體不出現在非糖尿病人的血清，但對小麥敏感的I型糖尿病患者血清檢測出高滴度的抗Glb 1抗體[21],提示小麥Glb 1蛋白與I型糖尿病的發生發展密切相關。然而小麥Glb 1蛋白介導的免疫反應及其在I型糖尿病發病中的作用機理尚不清楚。因此研制小麥Glb 1蛋白對I型糖尿病的發生發展研究有重要意義。小麥儲藏蛋白(Glb1)是一種球蛋白，在小麥胚乳和小麥麩質蛋白中含量豐富，研究顯示糖尿病大鼠Glb1的抗體濃度明顯高于非糖尿病對照組，且與胰腺的炎癥和破壞程度密切相關。Glb1不僅在小麥喂養的BB大鼠具有高抗原性，而且在I型糖尿病病人體內也具有高抗原性[22]。臨床資料顯示對小麥高度敏感的I型糖尿病患者表現過強的針對Glb1的免疫反應[21]?，F有研究表明Glb1與胰島β細胞損害密切相關，因此研究Glb1介導的免疫反應及其對胰島β細胞和胰島素分泌影響的機理，對于揭示I型糖尿病的病因和發病機理，為更有效的預防和治療I型糖尿病的提供理論依據。單克隆抗體因為其特異性強，靈敏度高且可以進行抗原表位分析的生物學特性在該研究中能發揮重要作用。本實驗以小麥Glb1-G3蛋白為免疫原，利用細胞融合技術．建立了穩定分泌抗Glb-1特異性單克隆抗體的細胞株。并對得到的這些單克隆抗體的生物學特性進行鑒定?？笹lb-1單克隆抗體的成功研制，對進一步探討Glb-1的生物學功能，闡明Glb-1與I型糖尿病的致病機制提供了有力的實驗工具?，F將制備該單克隆抗體的過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞株 5周齡雌性BALB /c小鼠，購自廣東省醫學實驗動物中心;小鼠骨髓瘤細胞NS-1由汕頭大學醫學院炎癥學與變態反應學實驗室贈與; 小麥Glb1-G3蛋白由美國GenScript The Biology CRO公司合成。

1.1.2 試劑 DMEM 高糖培養基、8-氮鳥嘌呤(8-AG)、HAT、HT、雙抗、胎牛血清(FBS)購于Gibco 公司;福氏完全佐劑、福氏 不完全 佐劑、羊抗小鼠IgG-HRP、Ig 類與亞類鑒定試劑盒、PEG SOLUTION購于Sigma 公司;鏈酶親和素-HRP 購于KPL 公司;蛋白Marker購于美國Fermentas 公司。

1.1.3 抗原信息 小麥Glb1-G3抗原是選取小麥Glb1蛋白序列第595至612位多肽人工合成，序列構成為：CEGFVAGPEQQSREQEQEQER，相對分子質量2 464.55。動物免疫用抗原為偶聯了Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH) 小麥GLB1-G3多肽。均由美國GenScript The Biology CRO公司合成。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細胞株的建立 取0.5 mg/mL的小麥Glb1-G3蛋白0.5 mL與等體積的福氏完全佐劑充分乳化后皮下多點注射于5只BALB/c小鼠，每只200 μL。每間隔3周改用福氏不完全佐劑加強免疫1次，劑量同前。第2次加強免疫后1周取尾血測效價。取其中免疫效果最好的小鼠融合前3 d經尾靜脈注射含50 μg小麥Glb1-G3蛋白的PBS溶液200 μL再加強免疫1次。小鼠骨髓瘤細胞NS-1于融合前兩周復蘇培養于含有8-氮鳥嘌呤的w=10%FBS高糖DMEM培養基中，融合前一天更換為普通培養基。細胞融合時，分別收集免疫小鼠脾細胞和NS-1 細胞，不完全培養基洗滌3 次后，調整脾細胞數與NS-1細胞數之比約為1∶5，w=50% PEG1500 作用1～2 min 后，加入含有HAT的完全培養基稀釋，接種于96 孔培養板，37 ℃，φ=5 % CO2培養。約2周后，用間接ELISA 法篩選陽性生長的細胞克隆孔，并更換為含有HT的完全培養基，1周后更換為完全培養基，有限稀釋法進行克隆及亞克隆。

1.2.2 單克隆抗體的制備及純化 注射0.5 mL液體石蠟至BALB/c小鼠腹腔。2周后注射1 mL 1×106的雜交瘤細胞。5～7 d后，收集腹水。室溫3 000 r·min-1離心5 min吸取上清。參照 HiTrap protein A親和層析說明書進行腹水的抗體純化。

1.2.3 單克隆抗體效價分析 使用間接ELISA方法對各株單克隆抗體腹水效價進行分析。用濃度為1 mg/mL的小麥Glb1-G3蛋白100 μL/孔包被，4 ℃過夜，洗板3次，w=3%BSA封閉37 ℃ 2 h，小鼠腹水以1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000、1∶2 048 000梯度稀釋后100 μL/孔 37 ℃孵育1 h，陰性小鼠血清為陰性對照，陽性小鼠血清為陽性對照，洗板5次，加入羊抗小鼠IgG-HRP作為二抗37 ℃孵育1 h，洗板3次，TMB顯色，終止后酶標儀測A450nm值。

1.2.4 單克隆抗體親和力測定 采用間接ELISA法，分別以1∶1、1∶2、1∶4的小麥Glb 1-G3蛋白抗原 (質量濃度1、0.5、0.25 mg/mL)包被酶標板，封閉后，依次加入倍比稀釋的4株單克隆抗體及羊抗小鼠IgG-HRP，加TMB顯色后，測定A450nm值。以每一株單克隆抗體的濃度為橫坐標，以其相應的A450nm值為縱坐標，分別繪出包被不同抗原濃度的3條反應曲線。以各曲線上部趨于平坦的A值作為100%，查出A450nm值為50%點對應的單克隆抗體的濃度[Ab]t，這樣每份被檢樣品在包被抗原濃度分別為1∶1、1∶2、1∶4時可得[Ab]t、[Ab’]t、[Ab’’]t3個值，然后按下列公式計算K值，當包被抗原濃度為1∶2時，K=1/2(2[Ab’]t-[Ab]t)和K=1/2(2[Ab”]t-[Ab’]t)計算，當包被抗原濃度為1∶4時，K=3/2(2[Ab”]t-[Ab]t)。這樣每株單克隆抗體可以得到3個K值，取3個K值的平均值即為親和常數, 以Ka表示

1.2.5 單克隆抗體亞型測定 間接ELISA方法，以標記辣根過氧化物酶的IgG，IgG1，IgG2a,IgE為二抗測定抗體亞型。

1.2.6 八大類食物過敏原交叉反應性檢測 將小麥Glb1-G3蛋白及小麥、大豆、榛子、花生、雞蛋、蝦、魚、牛奶8種食物過敏原包被在酶標板上，分別以4株單抗為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP為二抗，免疫前小鼠血清為陰性對照，免疫后小鼠血清為陽性對照，進行間接ELISA檢測，顯色后A450nm值。

1.2.7 雙抗夾心ELISA法檢測小麥Glb1-G3蛋白 利用ELISA方法對四種單抗進行兩兩配對實驗。將4種單抗包被酶標板，加入梯度稀釋的小麥Glb1-G3蛋白作為抗原37 ℃孵育1 h，洗板5次，分別加入用生物素標記的4種單抗兩兩配對，37 ℃孵育1 h，洗板3次，加入鏈酶親和素-HRP，TMB顯色，終止后酶標儀測A450 nm值。確定包被抗體與標記抗體的種類及稀釋度。用建立起來的雙抗夾心ELISA系統檢測小麥Glb1-G3蛋白。

2 實驗結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立

細胞融合率為 96.2% (452/470)，抗體陽性檢出率為 87.4% (411/470)，選擇其中較高讀數的 10 株進行克隆和亞克隆，最終獲得4株分泌抗小麥Glb1-G3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為：1C4、4H5、1A9、4F5。

2.2 單克隆抗體的制備及純化

將收集好的各單抗腹水參照 HiTrapprotein A親和層析說明書進行純化。純化后的抗體經過w=12%SDS-PAGE分析，可見清晰地2條蛋白條帶，位于55 000附近處的為抗體重鏈，位于26 000附近的為輕鏈(圖1)。

圖1 小麥Glb1-G3蛋白單克隆抗體純度鑒定Fig.1 Identification of the purity of McAbs against Glb1-G31:1C4; 2:4H5; 3: 4F5; 4: 1A9; 5: Protein Marker

2.3 單克隆抗體效價分析

將取得的小鼠腹水按一系列梯度稀釋，用間接 ELISA 法測定單抗的效價，4株抗體效價均超過200萬(圖2)。

圖2 單克隆抗體效價Fig.2 Detection of the potency of McAbs against Glb1-G3 allergen

2.4 單克隆抗體親和力測定

圖3 單克隆抗體的親和力檢測Fig.3 Aviclity of the monoclonal antibodies

分別以1∶1、1∶2、1∶4的小麥Glb1-G3蛋白抗原 (質量濃度1、0.5、0.25 mg/mL)包被酶標板，間接ELISA方法測定封閉后，依次加入倍比稀釋的4株單克隆抗體及羊抗小鼠IgG-HRP，加TMB顯色后，測定A450nm值。以每一株單克隆抗體的濃度為橫坐標，以其相應的A450nm值為縱坐標，分別繪出包被不同抗原濃度的3條反應曲線(圖3-6)。以抗體1C4為例，小麥Glb1-G3蛋白抗原包被質量濃度為1、0.5、0.25 mg/mL 時各曲線上部趨于平坦的A450nm值作為100%分別為3.802、3.88、3.92，則查出50%A450nm值1.901、1.94、1.96對應的單抗濃度分別是[Ab]t=2.83×10-11mol/L、[Ab’]t=1.96×10-10mol/L、[Ab’’]t=4.55×10-10mol/L三個值，然后按下列公式計算K值，當包被抗原濃度為1∶2時，K=1/2 (2 [Ab’]t-[Ab]t)=1.37×109L/mol和K=1/2 (2 [Ab”]t-[Ab’]t)=7.00×108L/mol計算[23]，當包被抗原濃度為1∶4時，K=3/2 (2 [Ab”]t-[Ab]t)=1.71×109L/mol。3個K值的平均值即為單抗1C4親和力常數Ka=1.26×109L/mol。同理，4H5、4F5、1A9的親和力常數分別為：7.24×109，4.79×109，4.59×109L/mol。

2.5 單克隆抗體亞型測定

用間接ELISA方法，以各單克隆抗體為一抗，標記辣根過氧化物酶的IgG，IgG1，IgG2a,IgE為二抗測定抗體亞型。檢測結果4株單抗皆為IgG1亞型。

圖4 單克隆抗體的亞型檢測Fig.4 Subtypes of the monoclonal antibodies

2.6 八大類食物過敏原交叉反應性檢測

將小麥Glb1-G3蛋白及小麥、大豆、榛子、花生、雞蛋、蝦、魚、牛奶8種食物過敏原包被酶標板，分別以4株單抗為一抗進行間接ELISA檢測，結果顯示：所制備的1C4、4H5、1A9、4F5 4株單克隆抗體與小麥Glb1-G3蛋白有很好的反應能力，與大豆、榛子、花生、雞蛋、蝦、魚、牛奶7種食物過敏原無交叉反應，4H5、4F5與小麥粗提蛋白可反應，1C4、1A9與小麥粗提蛋白反應能力較弱，可能與粗提蛋白中相關抗原含量低或者抗原結構有關。

圖5 單克隆抗體與常見食物過敏原的交叉反應Fig.5 Cross-reaction of the monoclonal antibodies with familiar food allergen

2.7 雙抗夾心ELISA法檢測小麥Glb1-G3蛋白

利用ELISA方法對四種單抗進行兩兩配對實驗,發現1C4與4H5可能為不同的抗原表位。棋盤法測定單抗1C4以1∶8 000稀釋度包被，生物素標記的4H5以1∶32 000稀釋度反應效果較好。小麥Glb1-G3蛋白做倍比稀釋，陰性對照孔用PBS代替抗原，以測定孔與陰性孔A450nm值之比大于2.1為陽性來檢測該方法對抗原的檢出范圍。該方法對小麥Glb1-G3蛋白的檢出限為3.75 ng/mL，標準曲線在3.75～120 ng/mL范圍內線性良好。

圖6 單克隆抗體對小麥蛋白Glb1-G3的檢測Fig.6 Detection of the wheat protein Glb1-G3 with the monoclonal antibodies

3 討 論

小麥經過長期的發展，已經成為世界上分布最廣、面積最大、總產量第二、貿易額最多、營養價值最高的糧食作物之一。全世界有43個國家，有35%～40%的人口以小麥為主要糧食。小麥子粒含有豐富的淀粉、較多的蛋白質、少量的脂肪，還有多種礦物質元素和維生素B，是一種營養豐富、經濟價值較高的商品糧。據聯合國糧農組織2004年統計，全世界小麥收獲面積32.36 億畝(1畝約為667 m2)，單產193.8 kg/畝，總產6.27 億t ，單產較高的國家主要集中在西歐。但是于此同時，小麥也是FAO 1995年所報道的八大類常見過敏食物[24]。糖尿病(Diabetes Mellitus)是一組與胰島素產生和作用異常相關、以血糖增高為特征的慢性疾病，該病及其并發癥具有危害大、治愈難、費用高等特點，已成為嚴重威脅人類健康的社會問題。糖尿病的發病原因眾多，從營養學角度來說，進食個體不耐受的食物以及紊亂的飲食結構是糖尿病發病的一個重要因素[25]。小麥及其相關產品在日常飲食中的廣泛攝入，使小麥成為主要的食物蛋白來源，但同時也成為主要的食物過敏原。小麥過敏可以誘發哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻疹、乳糜瀉腸炎等癥狀[26]。小麥儲藏蛋白作為小麥的主要過敏原，本研究是根據小麥儲藏蛋白在小麥過敏中的重要作用利用雜交瘤技術制備抗Glb-1特異性單克隆抗體，并鑒定其生物學特性，為研究Glb-1與I型糖尿病的關系提供了研究基礎。

根據軟件分析Glb-1蛋白的結構，選擇性的選取了兩段親水、暴露、無轉角且抗原性強的肽段表達分別命名為G1、G2。經免疫和細胞融合后證實G1、G2免疫BALB/C小鼠后ELISA檢測雜交瘤細胞抗體檢出陽性率較低。而用于免疫小鼠的Glb-1 G3肽段是根據文獻報道將2段與糖尿病相關的短肽人工合成表達，G3序列構成為：CEGFVAGPEQQSREQEQEQER，相對分子質量2 464.55，實驗結果G3免疫后的BALB/C小鼠脾細胞與NS-1細胞融合后檢測融合率和抗體陽性率均較理想。 本實驗利用細胞融合技術制備了小鼠抗Glb-1的雜交瘤細胞，細胞融合率較高且用Glb-1 G3包被ELISA檢測出的抗陽性檢出率理想。經過對ELISAA值讀數較高的10株進行克隆和亞克隆，最終獲得4株穩定分泌抗小麥Glb1-G3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為：1C4、4H5、1A9、4F5。 通過向小鼠注射這4株雜交瘤細胞后收集腹水通過親和層析進行純化。將小鼠腹水梯度稀釋后用間接ELISA法測定單抗的效價，4株抗體效價均超過200萬。且經檢測后4株單抗皆為IgG1亞型。4株單抗為一抗分別與八大類食物進行交叉反應性檢測結果表明該4株單抗均能特異性識別小麥Glb-1蛋白且與其他主要食物均無交叉反應，特異性強. 雙抗夾心ELISA法檢測小麥Glb1-G3蛋白實驗發現1C4與4H5可能為不同的抗原表位，可以準確檢測Glb-1蛋白，可以制備小麥過敏原檢測試劑盒，具有實際應用價值。

綜上所述，本研究已獲得鼠抗小麥Glb-1單克隆抗體，為研究小麥過敏與臨床疾病的關系和小麥主要過敏原蛋白的蛋白的檢測了研究工具和研究依據，同時也為小麥Glb-1蛋白的結構和生物學功能研究奠定了基礎。

[1] LEFEBVRE D E,POWELL K L, STROM A, et al. Dietary proteins as environmental modifiers of type 1 diabetesmellitus[J]. Annu Rev Nutr，2006,26:175-202.

[2] PATRICK C, WANG G S, LEFEBVRE D E, et al. Promotion of autoimmune diabetes by cereal diet in the presence or absence of microbes associated with gut immune activation, regulatory imbalance, and altered cathelicidin antimicrobial peptide[J].Diabetes,2013, 62(6): 2036-2047.

[3] ONKAMO P, VAANANEN S, KARVONEN M,et al. Worldwide increase in incidence of type I diabetes—the analysis of the data on published incidence trends[J].Diabetologia,1999;42:1395-1403.

[4] GALE E A.The rise of childhood type 1 diabetes in the twentieth centry[J].Diabetes,2002,51:3335-3361.

[5] GILLESPIE K M, BAIN S C, BARNETT A H, et al. The rising incidence of childhood type 1 diabetes and reduced contribution of highrisk HLA haplotypes[J]. Lancet, 2004,364:1645-1647.

[6] LIESE A D,MA X, MAAHS D M, et al. Physical activity, sedentary behaviors, physical fitness, and their relation to health outcomes in youth with type 1 and type 2 diabetes: A review of the epidemiologic literature[J]. Journal of Sport and Health Science, 2013,2(1): 21-38.

[7] 許曼音,陸廣華,陳名道.糖尿病學[M].2版.上海:上?？茖W技術出版社, 2010:87-92.

[8] ELLIOTT R B, MARTIN J M. Dietary protein: a trigger of insulin-dependent diabetes in the BB rat?[J]. Diabetologia,1984,26:297-299.

[9] ISSA-CHERGUI B,GUTTMANN R D,SEEMAYER T A,et al. The effect of diet on the spontaneous insulin dependent diabetic syndrome in the rat[J]. Diabetes Res, 1988,9:81-86.

[10] VISSER J, BRUGMAN S, KLATTER F, et al. Short-term dietary adjustment with a hydrolyzed casein-based diet postpones diabetes development in the diabetes-prone BB rat[J]. Metabolism-Clinical and Experimental,2003,52(3): 333-337.

[11] MAURANO F,ROSSI M, TRONCONE R. Gut involvement in NOD mouse diabetes[J]. Immunology Endocrine & Metabolic Agents in Medicinal Chemistry,2007,7(3): 211-217.

[12] GRAHAM S, COURTOIS P, MALAISSE W J, et al. Enteropathy precedes type 1 diabetes in the BB rat[J]. Gut, 2004,53:1437-1444.

[13] VAARALA O, ATKINSON M A, NEU J. The “perfect storm” for type 1 diabetesthe complex interplay between intestinal microbiota, gut permeability, and mucosal immunity[J]. Diabetes, 2008, 57(10):2555-2562.

[14] MACFARLANE A J,BURGHARDT K M， KELLY J,et al. A type 1 diabetes-related protein from wheat (Triticumaestivum)cDNA clone of a wheat storage globulin, glb1, linked to islet damage[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2003,278: 54-63.

[15] SCOTT F W,SARWAR G,CLOUTIER H E. Diabetogenicity of various protein sources in the diet of the diabetes-prone BB rat[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1989, 246: 277-285.

[16] COLEMAN D L, KUZAVA J E, LEITER E H. Effect of diet on incidence of diabetes in nonobese diabeticmice[J]. Diabetes,1990,39:432-436.

[17] ANTVORSKOV J C, FUNDOVA P, BUSCHARD K,et al. Dietary gluten alters the balance of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in T cells of BALB/c mice[J]. Immunology , 2013,138(1):23-33.

[18] ZIEGLER A G, SCHMID S, HUBER D, et al.Early infant feeding and risk of developing type 1 diabetes-associated autoantibodies[J]. JAMA,2003,290:1721-1728.

[19] NORRIS J M, BARRIGA K, KLINGENSMITH G, et al. Timing of initial cereal exposure in infancy and risk of islet autoimmunity [J]. JAMA, 2003, 290:1713-1720.

[20] SCOTT F W, MONGEAU R, KARDISH M, et al. Diet can prevent diabetes in the BB rat[J].Diabetes,1985,34(10): 1059-1062.

[21] MOJIBIAN M,CHAKIR H,MACFARLANE A J, et al.Immune reactivity to a Glb 1 homologue in a highly wheat-sensitive patient with type 1 diabetes and celiac disease [J].Diabetes Care, 2006, 29(5):1108-1110.

[22] SIMPSON M, MOJIBIAN M, BARRIGA K,et al. An exploration of Glo-3A antibody levels in children at increased risk for type 1 diabetes mellitus[J].Pediatric Diabetes, 2009,10(8): 563-572.

[23] 柳忠輝. 醫學免疫學實驗技術[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2008: 22-23.

[24] Food and Agriculture Organization of the United Nations Report of the FAO technical consultation on food allergies[C].Rome, Italy:Food and Agriculture Organization of the United Nations, 1995.

[25] 錢榮立.飲食紊亂與糖尿病[J].中國糖尿病雜志, 2012,20(1):5-6.

[26] JOHANSSON S, HOURIHANE J, BOUSQUET J, et al. A revised nomenclature for allergy: An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force [J]. Allergy,2001,56(9): 813-824.