放療聯(lián)合TK/GCV自殺基因系統(tǒng)對肺腺癌細胞凋亡活性的影響

康保國，陳 宏，楊 茜，曹學武，紀 華

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院腫瘤科，昆明 650032)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著環(huán)境污染的不斷加重，肺癌患者的數量逐年增加[1-2]。然而，常規(guī)的手術、放療、化療和生物治療雖然在一定程度上延長了患者的生存期，但大部分患者最終由于腫瘤復發(fā)、轉移而導致治療失敗，因此研究更加有效的肺癌治療方法，對于延長患者生存期、提高患者的生存質量具有重要意義。本研究利用前期研究構建的同步放大基因電路系統(tǒng)提高目的基因胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因的表達，通過放療聯(lián)合TK/丙氧鳥苷(ganciclovir，GCV)自殺基因系統(tǒng)共同作用，促進肺腺癌細胞凋亡，以探尋肺癌治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1材料 抗性篩選試劑G418為美國MBI公司產品，lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，含10%胎牛血清的達爾伯克必需基本培養(yǎng)液為美國Gibco公司產品，凋亡檢測試劑盒轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(TUNEL)法購自瑞士Roche公司，人肺腺癌細胞株(A549細胞)為本科室儲備。放射源：X射線(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院腫瘤放療中心)。

1.2方法 將前期研究中構建的pfos-iNOS/TK治療載體轉染A549細胞。G418篩選陽性克隆。分別取轉染治療載體的細胞(轉染治療載體組)和未轉染的對照細胞(未轉染組)通過反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase/polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測細胞中TK基因的表達。將陽性轉染細胞和未轉染的A549細胞按0.6×104/孔。分別接種于4個96孔板,每板接種20孔，轉染治療載體組和未轉染組各2個(并于1個未接種的孔內加入同種培養(yǎng)液作為空白孔)。其中，1個96孔板中轉染pfos-iNOS/TK的A549細胞每孔中加入10 μmol/L GCV，1個未轉染的A549細胞每孔中加入1000 μmol/L GCV；另外2個板給予2 Gy X射線照射，8 h后于受照射的培養(yǎng)板中每孔加入10 μmol/L GCV。于照射后36 h，輕輕吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，枸櫞酸鹽緩沖液漂洗；干燥后，用4%多聚甲醛溶液固定，室溫放置1 h。按照TUNEL法檢測各組細胞的凋亡率[3]。光鏡下觀察細胞凋亡百分率,至少觀察5個視野,計數200個細胞，計數各組表達陽性細胞百分比。

2 結 果

2.1治療載體在轉染細胞基因組內整合檢測 取轉染治療載體及未轉染A549細胞提取RNA，經RT-PCR反應、電泳、凝膠成像結果見圖1。在轉染細胞中RT-PCR檢測到轉染的TK基因片段，而未轉染的A549細胞中只能檢測到內參，未檢測到TK基因。

a.未轉染細胞 b.轉染細胞 c.空白對照圖1 RT-PCR檢測目的基因TK在轉染細胞和未轉染細胞中的表達

2.2GCV對轉染治療載體組和未轉染組細胞凋亡的影響 轉染治療載體組的細胞給予10 μmol/L GCV即可檢測到細胞凋亡，但凋亡率較低，為(16.8±0.52)%(圖2，見封三)；未轉染的A549細胞給予1000 μmol/L GCV僅可觀測到極少的細胞發(fā)生凋亡，為(6.2±0.61)%(圖3，見封三)。轉染治療載體組與未轉染組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(t=2.086，P=0.025)。

2.3放療聯(lián)合GCV對轉染細胞和未轉染細胞凋亡活性的影響 兩種細胞都給予2 Gy X射線照射聯(lián)合GCV作用后，轉染治療載體組大量細胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(86.58±0.83)%(圖4，見封三)，而未轉染組僅有少量細胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(28.3±0.69)%(圖5，見封三)，轉染治療載體組與未轉染組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(t=3.012，P=0.005)。

3 討 論

由于環(huán)境污染的不斷加重及肺癌診斷水平的提高，近年來肺癌的發(fā)病率不斷增加[4]。雖然生物靶向治療藥物的出現給肺癌患者提供了新的治療選擇，但并沒有從根本上有效降低肺癌的病死率。TK/GCV自殺基因系統(tǒng)通過將前藥酶基因導入細胞后能夠編碼相應的酶，后者可將一些無毒或低毒的物質(GCV)代謝成具有毒性的物質，從而導致瘤細胞死亡[5-6]。然而，單純TK/GCV自殺基因系統(tǒng)的臨床療效通常不十分理想,主要原因之一是經基因轉導的腫瘤細胞，TK表達水平低且僅限于部分腫瘤細胞；另外，有效劑量的GCV[100 mg(kg·d)]對機體可能產生嚴重的毒性效應,主要并發(fā)癥有腎功能受損(40%～60%)和骨髓抑制(20%～41%)等[7],限制了TK基因治療的療效和應用范圍。前期研究證實,通過放射誘導的同步放大基因電路系統(tǒng)可以調控目的基因TK高效、特異性表達，從而解決了基因表達效率低、特異性差的問題[1]。

本研究中，轉染治療載體細胞內通過RT-PCR檢測到TK基因的表達，而未轉染細胞內無TK基因表達，說明TK基因與被轉染細胞基因成功整合。轉染治療載體組的細胞給予10 μmol/L GCV即可檢測到細胞凋亡，但凋亡率較低，再一次證實了單純TK/GCV自殺基因系統(tǒng)誘導細胞凋亡的效率低[8]。給予2 Gy X射線照射聯(lián)合GCV作用后，轉染治療載體組大量細胞發(fā)生凋亡，究其原因:一方面，X射線激活放射誘導的同步放大基因電路，顯著提高了TK/GCV自殺基因系統(tǒng)的殺傷效率，另一方面，高濃度的一氧化氮既有直接的瘤細胞殺傷作用，又可以提高瘤細胞的放療敏感性[9-10]。這樣，由X射線、GCV、一氧化氮三者共同作用，進一步提高了肺癌細胞的凋亡比率。

有關基因治療的試驗研究層出不窮，預期效果也令人滿意，但真正應用到臨床治療當中帶來的治療獲益比并不高[11]。這可能與基因治療技術中存在的基因靶向轉移困難、基因表達水平低且短暫、轉移后基因表達缺乏有效的調控手段以及腫瘤病因復雜而缺乏有效目的基因等因素有關[12]。因此，研究開發(fā)轉染效率更強、特異性更高的載體和調控更加精細、準確的轉錄序列將使更多的肺癌患者受益于腫瘤基因治療。

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