p－Akt、p－FoxO1在尋常型銀屑病皮損中的表達

黃莉寧 薛汝增 羅光浦 陳勇軍 曲永彬 吳鐵強 林爾藝 陳永鋒

·短篇論著·

p－Akt、p－FoxO1在尋常型銀屑病皮損中的表達

黃莉寧 薛汝增 羅光浦 陳勇軍 曲永彬 吳鐵強 林爾藝 陳永鋒?

目的: 檢測p－Akt和p－FoxO1蛋白在尋常型銀屑病皮損中的表達。方法: 收集30例尋常型銀屑病患者的皮損及30名健康對照皮膚組織,采用Western blot法檢測p－Akt和p－FoxO1的表達。結果: 與正常皮膚組相比,尋常型銀屑病皮損中p－Akt和p－FoxO1的表達水平明顯上調,兩組具有統計學差異(P＜0.05)。結論: Akt和FoxO1可能與銀屑病皮損中角質形成細胞的異常增殖有關。

尋常型銀屑病； FoxO1； Akt； 蛋白印跡法

尋常型銀屑病是一種紅斑鱗屑性疾病,其發病率高、難治愈、易復發,嚴重影響患者的身心健康。目前認為本病是遺傳因素與環境因素等多種因素相互作用的多基因遺傳病,通過免疫介導的共同信號通路引起角質形成細胞過度增殖。1組織病理具有角質形成細胞過度增殖和真皮乳頭血管新生且迂曲擴張等特點。2目前引起角質形成細胞過度增殖的機制尚未闡明。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase, PI3K)/Akt信號轉導通路是細胞存活的重要通路,參與細胞生長、細胞增殖等多個過程。FoxO1作為其下游的效應靶蛋白,在細胞生長、細胞增殖中亦發揮重要作用。本研究對尋常型銀屑病皮損中Akt及其下游效應靶蛋白FoxO1的磷酸化水平進行檢測,探討其在銀屑病發病過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集本院2012年門診和住院的尋常型銀屑病患者30例,其中男15例、女15例,年齡16～54歲,平均36.2歲,病史0.5個月至27年,所有病例均具有典型皮損并經組織病理診斷,本次發病以來均未經任何治療。健康對照組30例,來自我院皮膚外科手術多余的正常皮膚或手術環切的包皮。取材后,將標本立即置于液氮中冷凍保存。本研究經醫院倫理委員會通過并與患者簽署知情同意書。

1.2 試劑 p－Akt1/2/3(Ser473)、β－actin多克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司,p－FoxO1(S256)多克隆抗體購于美國Abcom公司,AP標記的山羊抗兔多克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術公司,10%SDS－PAGE預制膠購于上海生工生物工程公司,聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購于美國PALL公司,BCA法蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液、ECL顯色試劑盒、Tris－甘氨酸電泳緩沖液、半干轉膜液及其它試劑購于江蘇碧云天生物技術公司。

1.3 Western blot檢測 從液氮中取出凍存的標本,用眼科剪將組織剪切成細小的碎片并用組織勻漿器勻漿,RIPA細胞裂解液(內含PMSF)冰上裂解細胞, BCA法測定蛋白濃度,取50 μg總蛋白變性后進行SDS－PAGE恒壓電泳,半干法將電泳產物轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉4℃封閉2 h,滴加一抗(1∶1000),4℃過夜,TBST洗膜4次,每次10 min,滴加二抗(1∶5000),37℃孵育2 h,TBST洗膜4次,每次10 min,按ECL試劑盒說明進行顯色,在自動電泳凝膠成像分析系統下自動成像,分析目的蛋白條帶的平均灰度值,以β－actin蛋白作為內參,以目的蛋白與β－actin的灰度比值作為目的蛋白的相對含量,進行統計學分析。

1.4 統計學方法 所有數據以ˉx±s表示,采用SPSS 16.0軟件進行統計分析,每兩組相對灰度值之間的比較采用t檢驗,P＜0.05有統計學意義。

2 結果

尋常型銀屑病皮損中p－Akt及p－FoxO1的相對灰度值為1.02±0.27和1.83±0.61,與健康對照組0.55 ±0.09和0.69±0.12相比,具有顯著統計學差異(t＝5.41,P＜0.05)。結果見圖1、2。

圖1 兩組灰度值電泳圖

圖2 兩組灰度值比較

3 討論

研究發現,尋常型銀屑病皮損組織中角質形成細胞的增生速度是正常表皮的2倍,而其細胞周期縮短了8倍(36 h比311 h),每日生成的角質形成細胞數量高出正常表皮的28倍。3角質形成細胞良性過度增殖是尋常型銀屑病的病理特征之一,而對其過度增殖的機制目前仍未完全闡明。李政霄等4發現上皮鈣黏素和β連環蛋白表達下調可能與銀屑病角質形成細胞高度增殖有關；劉厚君等5發現細胞周期蛋白A、D1、B1和E可能通過誘導細胞增殖參與了銀屑病的發病。但這些研究僅局限于下游效應分子的表達,對于上游信號傳導的調控未闡明。為此,本研究將PI3K/Akt信號通路及下游FoxO1蛋白作為研究靶點,進一步闡明其可能的發病機制。

PI3K/Akt信號通路是細胞內一條調控細胞增殖的重要通路,Akt是PI3K下游直接的靶蛋白,屬于一種癌基因,因其與蛋白激酶A和C有高度同源性,又被命名為蛋白激酶B(簡稱PKB)。6Akt是PI3K信號通路關鍵的分子,通過磷酸化其下游糖原合成酶激酶－3、Bad(Bcl－2家族成員)、FoxO家族等蛋白來調控細胞的增殖與凋亡。7,8本研究發現,銀屑病皮損中p－ Akt的表達水平明顯上調,這與張曉艷等9的研究結果一致。既往研究銀屑病中PI3K/Akt信號下游轉導通路局限于Bad及mROT,形成PI3K/Akt/mROT通路,10而對于Fox蛋白家族的表達情況,研究較少。

Fox蛋白(forkhead box)是脊椎動物叉頭樣轉錄因子的總稱,2000年正式統一命名,是一個具有多種功能的轉錄因子大家族,通常和細胞生長發育的調控有關。11該家族的共同特征是具有一個長110個氨基酸的DNA結合結構域,稱為Fox結構域,折疊成3個α螺旋和2個翅膀狀(winged)的大環結構。至今已經定義了17類Fox蛋白,即FoxA～Q,目前研究最多的是FoxO亞家族。12FoxO在進化上高度保守,氨基酸序列中含有3個Akt磷酸化基序,是胰島素/胰島素樣生長因子信號通路中的關鍵因子,其上游受PI3K/Akt磷酸化級聯通路的調節,下游靶基因則與細胞增殖、分化、代謝、凋亡及基因表達密切相關。13FoxO1作為FoxO家族的重要亞成員之一,主要在脂肪組織高表達,在生長因子或胰島素刺激下,通過Akt依賴的Thr32、Ser253和Ser315三個特殊位點的磷酸化而受到調控。這種Akt依賴的磷酸化發生后,改變FoxO1蛋白的亞細胞定位,使其從細胞核向胞漿轉移,失去轉錄因子的活性,減少其下游靶基因的合成,從而失去對細胞增殖的抑制,導致細胞的過度增殖。

由此推測,銀屑病皮損內的炎癥因子激活PI3K,進一步活化Akt,磷酸化的Akt導致下游的FoxO1磷酸化水平升高,使其從細胞核向胞漿轉移,失去轉錄因子的活性,導致下游效應分子的表達異常,使得角質形成細胞出現過度增殖。本研究結果顯示尋常型銀屑病皮損中Akt、FoxO1的磷酸化水平增高,證實了該推論。

1張學軍.皮膚性病學.7版.北京:人民衛生出版社,2008.141－144.

2朱學駿,涂平.皮膚病的組織病理診斷.2版.北京:北京大學醫學出版社,2001.65－67.

3鄭敏.銀屑病發病機制研究中若干問題的思考.中華皮膚科雜志,2006,39(3):121－123.

4李政霄,紀泛撲,彭振輝,等.上皮鈣粘素、β－連環蛋白、細胞周期素D1在進行期尋常型銀屑病皮損的表達.南方醫科大學學報,2008,28(4):545－547.

5劉厚君,吳艷,林能興,等.尋常型銀屑病皮損中細胞周期蛋白A、D1、B1和E的表達.中國麻風皮膚病雜志,2007,23 (2):98－100.

6 Vandermoere F,El YI,Adriaenssens E,et al.The antiapoptotic effect of fibroblast growth factor－2 is mediated through nuclear factor－kappaB activation induced via interaction between Akt and IkappaB kinase－beta in breast cancer cells.Oncogene, 2005,24(35):5482－5491.

7 Fatrai S,Elghazi L,Balcazar N,et al.Akt induces beta－cell proliferation by regulating cyclin D1,cyclin D2,and p21 levels and cyclin－dependent kinase－4 activity.Diabetes,2006,55 (2):318－325.

8 Parcellier A,Tintignac LA,Zhuravleva E,et al.PKB and the mitochondria:AKTing on apoptosis.Cell Signal,2008,20(1): 21－30.

9張曉艷,周平,尤立平,等.銀屑病皮損表皮內Akt的激酶活性增強.中華皮膚科雜志,2009,42(6):413－416.

10 Chen L,Wu J,Pier E,et al.mTORC2－PKBalpha/Akt1 Serine 473 phosphorylation axis is essential for regulation of FOXP3 stability by chemokine CCL3 in psoriasis.J Invest Dermatol,2013,133(2):418－428.

11 Kaestner KH,Knochel W,Martinez DE.Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors.Genes Dev, 2000,14(2):142－146.

12 Huang H,Tindall DJ.Dynamic FoxO transcription factors.J Cell Sci,2007,120(Pt 15):2479－2487.

13 Essafi A,Gomes AR,Pomeranz KM,et al.Studying the subcellular localization and DNA－binding activity of FoxO transcription factors,downstream effectors of PI3K/Akt.Methods Mol Biol,2009,462:201－211.

(收稿:2014－04－05 修回:2014－05－27)

The expressions of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris

HUANG Li-ning,XUE Ru-zeng,LUO Guang-pu,et al.Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou,510091

Objective:To detect the expression of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris. Methods:The levels of p－Akt and p－FoxO1 were detected by Western Blot in the lesions from 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin specimens from 30 healthy controls.Results:Compared with the controls,the expressions of p－Akt and p－FoxO1 were significantly up－regulated in psoriasis vulgaris lesions(P＜0.05).Conclusion:p－Akt and p－FoxO1 may contribute to the abnormal proliferation of keratinocytes in the lesions of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；FoxO1；Akt；Western blot

廣東省皮膚病醫院,廣東廣州,510091

?通信作者