MAPK對RBP4誘導炎性反應的調節機制及研究

吳桂平 付 鑫* 張彥紅 鄒慕蔚 鄧會明 晏 寧

（沈陽醫學院附屬第二醫院心內科，遼寧 沈陽 110035）

MAPK對RBP4誘導炎性反應的調節機制及研究

吳桂平 付 鑫* 張彥紅 鄒慕蔚 鄧會明 晏 寧

（沈陽醫學院附屬第二醫院心內科，遼寧 沈陽 110035）

目的 探討MAPK對視黃醇蛋白4（RBP4）誘導炎性反應的調節機制。方法 利用大鼠胸主動脈內皮細胞作為研究對象，首先檢測了RBP4對白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平的調節作用，其次，通過PI3K特異性抑制劑（wortmannin）作用下，檢測PI3K的mRNA水平，同時檢測RBP4對白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平的調節作用變化。結果 RBP4能夠顯著上調白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平（P＜0.05）。在wortmannin作用下，PI3K的mRNA水平顯著下調，白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平顯著下調（P＜0.05）。在過表達PI3K病毒作用下，白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α的mRNA水平顯著上升（P＜0.05）。結論 本實驗初步研究得出MAPK對RBP4誘導的炎性反應具有調節作用。

視黃醇蛋白4；MAPK；PI3K；炎性反應

視黃醇蛋白-4（RBP4）是負責轉運維生素A的載體蛋白，在正常狀態下，RBP4主要產生于肝臟，但脂肪組織也會產生RBP4[1]。有研究顯示，在2型糖尿病中發現RBP4水平顯著上升。臨床調查顯示，RBP4在血液中的含量與心血管疾病風險因子低密度脂蛋白（LDL）也有緊密的關系。動脈粥樣硬化疾病的發病機制目前尚未解決，但當前的研究發現，該疾病的初期具有血管內皮炎性反應的癥狀。動脈粥樣硬化前期，RBP4能夠誘導血管內皮細胞的炎性反應，而PI3K/ MAPK信號通路在血管內皮細胞的炎性反應、增殖等方面均具有關鍵作用，本實驗在此基礎上，旨在研究MAPK對RBP4誘導炎性反應的調節機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

原代培養大鼠胸主動脈內皮細胞在10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃，5% CO2待傳至4～6代則用于實驗。

1.2 試劑及儀器

Trizol（Invertrogen），SYBR Green（Toyobo），反轉錄試劑盒（Toyobo），0. 25% 胰酶（上海生工）、新生牛血清（維森特）、細胞孵育箱（THERMO公司）、超凈工作臺（安泰）、SD大鼠（ 南京青龍山）。

1.3 RNA 提取

取傳至4～6代大鼠胸主動脈內皮細胞，吸棄培養液，添加1 mL冰浴PBS，利用移液器反復輕微吹打細胞，致細胞脫落，1000 rpm/min離心細胞收取，轉至1.7 mL離心管，加入1 mL Trizol溶液，加入0.2 mL氯仿。Vortex混勻，5 min室溫靜置，然后11000 rmp離心，時間為15 min。將上層的水相轉入到1.5 mL EP管，添加等體積異丙醇，Vortex混勻，然后放于-20 ℃冰箱中，過0.5 h后，11000 rmp離心，10 min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1 mL 75%的乙醇，然后洗滌RNA沉淀，最后7000 rmp離心6 min。棄上清，靜置5 min。

1.4 RT-PCR

NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR試劑盒說明書進行。

反轉錄反應條件：37 ℃ 25 min（RT-PCR反應）；85 ℃ 5 s（酶失活反應）。

1.5 實時熒光定量Q-PCR

用Primer Premier 5.0的軟件設計、并合成了相關基因引物，上海博尚生物技術有限公司合成引物，其特異性利用融解曲線進行分析驗證。cDNA表達豐度采用Ct值進行檢測，β-actin的Ct值作為內參。反轉錄結束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按說明書進行熒光定量PCR。

1.6 統計學處理

采用SPSS軟件進行統計處理。所有數據采用mean±SE顯示，實驗組與對照組之間的差異比較，用兩樣本的均數t檢驗，P＜0.05定為統計學上顯著性的差異。

2 結 果

2.1 RBP4誘導大鼠胸主動脈血管內皮細胞發生炎性反應

實驗組以4 μg/mL的RBP4加入DMEM培養基孵育大鼠胸主動脈血管內皮細胞5 min，然后換用無RBP4的DMEM培養基培養1 d后，進行RNA抽取及熒光定量PCR。對照組加入等量的生理鹽水孵育5 min，然后換用無RBP4的DMEM培養基培養1 d后，進行RNA抽取及熒光定量PCR。表1結果顯示，相比于對照組，實驗組的炎性基因白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α均顯著上調，具有統計學差異（P＜0.05）。

表1 兩組炎性基因mRNA表達的對比情況（）

表1 兩組炎性基因mRNA表達的對比情況（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 IL-6 IL-2 TNF-α對照組 1.0±0.1 1.1±0.1 0.9±0.1實驗組 4.1±0.1* 3.9±0.2* 5.2±0.2*

2.2 PI3K抑制劑減弱了RBP4對血管內皮細胞炎性反應

實驗組添加10 mmol/L的PI3K抑制劑于大鼠胸主動脈內皮細胞孵育10 min，然后以4 μg/mL的RBP4加入DMEM培養基孵育大鼠胸主動脈血管內皮細胞孵育5 min，換用無RBP4的DMEM培養基培養1 d后，進行RNA抽取及熒光定量PCR。模型組參照2.1的實驗組加藥方法。對照組參照2.1對照組的加藥方法。表2結果顯示，相比于對照組，實驗組的炎性基因白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α均顯著上調，具有統計學差異（P＜0.05）。

表2 三組炎性基因mRNA表達的對比情況（）

表2 三組炎性基因mRNA表達的對比情況（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 IL-6 IL-2 TNF-α對照組 1.1±0.2 1.0±0.2 1.0±0.2模型組 4.2±0.3 3.8±0.1 4.8±0.1實驗組 1.4±0.1* 1.4±0.1* 1.5±0.1*

2.3 過表達PI3K病毒增強了RBP4對血管內皮細胞炎性反應

實驗組添加PI3K過表達病毒5 μL于大鼠胸主動脈內皮細胞孵育24h，然后以4μg/mL的RBP4加入DMEM培養基孵育大鼠胸主動脈血管內皮細胞孵育5min，換用無RBP4的DMEM培養基培養1天后，進行RNA抽取及熒光定量PCR。模型組參照2.1的實驗組加藥方法。對照組參照2.1對照組的加藥方法。表3結果顯示，相比于對照組，實驗組的炎性基因白細胞介素-2、白細胞介素-6以及TNF-α均顯著上調，具有統計學差異（P＜0.05）。

表3 三組炎性基因mRNA表達的對比情況（）

表3 三組炎性基因mRNA表達的對比情況（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 IL-6 IL-2 TNF-α對照組 1.0±0.3 1.0±0.1 0.9±0.1模型組 4.1±0.2 3.6±0.3 4.9±0.3實驗組 7.0±0.3* 6.0±0.2* 6.8±0.2*

3 討 論

RBP4是一種炎性糖蛋白，通過提高趨化性，細胞附著和細胞 遷移和重組，組織結構重塑，參與到血管內皮功能障礙中來，作為對血管內皮細胞受損的反應。RBP4的蛋白表達可見于動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞和平滑肌細胞，在動脈粥樣硬化損傷的早期以最高表達見于巨噬細胞中[2]。內皮功能障礙和動脈粥樣硬化中的RBP4參與炎癥和動脈過程，表明RBP40有可能在內皮功能障礙和動脈粥樣硬化中起作用。這些在體外的根瘤形成過程模仿一些在體內變化的特點，這些變化發生在受傷后的VSMCs中，在這里媒介平滑肌細胞分化，遷移和作用于再狹窄和內膜的形成過程[3]。在體外還研究發現，RBP4促進血管內皮細胞的趨化性，細胞黏著，擴展和遷移，這表明RBP4在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中起作用，在這一過程中平滑肌細胞被誘導遷移過內膜，作為對外源信號的反應。RBP4也通過促進分支小管的形成來調整血管內皮細胞的形態，表明RBP4通過激發VSMCs的遷移和重組在血管再生術中起作用[4]。這些在體外的研究有免疫組織化學的分析作支持，它們揭示了體內RBP4在人體動脈粥樣硬化斑的平滑肌細胞中的蛋白表達。一些研究表明，提高血清中RBP4含量水平獨立地關聯于冠心病的出現及其程度，甚至發現在有心肌梗死的患者病例中含有更高水平的RBP4。另外還發現，提高血清中RBP4含量除了與心血管死亡有關外，還與其他各種原因有關。最后，在1型和2型糖尿病患者中也發現了RBP4含量的升高，與非糖尿病人群相比，這增大了患心血管疾病的風險。在1型糖尿病患者中，提高RBP4循環和蛋白尿之間的正相關，表明了RBP4在進行性血管損傷導致微脈管疾病中的作用。

綜上所述，MAPK能夠介導RBP4對血管內皮細胞的炎性反應，為今后研究動脈粥樣硬化的發生機制提供了一定的理論和實驗基礎。

[1] Erikstrup C,Mortensen O,Pedersen BK.Retinol-binding protein 4 and insulin resistance (letter to the editor)[J]N Engl J Med,2006,23 (355):1393-1394.

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The Regulation of MAPK on the Inflammatory Response induced by RBP4

WU Gui-ping, FU Xin, ZHANG Yan-hong, ZOU Mu-wei, DENG Hui-ming, YAN Ning
(Department of Cardiology, Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110035, China)

Objective To explore the mechanisms of regulation of MAPK on the inflammatory response induced by retinol protein 4 (RBP4). Methods The rat aortic endothelial cells as an object of study, first detected RBP4 dialogue interleukin-2, the regulatory role of interleukin-6, and TNF-α mRNA levels, and secondly, the role of PI3K specific inhibitor (wortmannin) , the detection of mRNA levels of PI3K simultaneous detection of the changes of the regulatory role of RBP4 interleukin-2, interleukin-6 and of TNF-α mRNA levels. Results RBP4 significant upregulation of interleukin-2, interleukin-6, as well as of TNF-α mRNA levels (P＜0.05). Wortmannin role of PI3K mRNA level significantly lowered, interleukin-2, interleukin-6 as well as of TNF-α the mRNA level significantly significantly lowered (P＜0.05) in the over-expression of PI3K virus, interleukin-2, interleukin prime -6, and TNF-α mRNA levels increased significantly (P＜0.05). Conclusions In this study, preliminary studies MAPK-induced inflammatory response of RBP4 has a regulatory role.

RBP4; MAPK; PI3K; Inflammatory

R541.4

：B

：1671-8194（2014）07-0009-02

沈陽市科技計劃項目（計劃文號：沈科發[2011]21號；項目編號：F11-262-9-41；合同編號：11318）

*通訊作者：E-mail:fuxin678@163.com