PA感染與定植中血液PEA變化的研究

傅玉瓊 周 偉 熊 彬 湛曉勤*

（四川省瀘州醫學院附屬醫院呼吸內科，四川 瀘州 646000）

PA感染與定植中血液PEA變化的研究

傅玉瓊 周 偉 熊 彬 湛曉勤*

（四川省瀘州醫學院附屬醫院呼吸內科，四川 瀘州 646000）

目的 探討銅綠假單胞菌外毒素（PEA）在銅綠假單胞菌肺部感染及定植表達差異的臨床價值。方法 SD大鼠180只，隨機分為PA（銅綠假單胞菌）感染模型組，PA咽部定植組及生理鹽水對照組。觀察PA感染與定植中血液PEA變化。結果 肺組織結構正常，定植組與對照組無明顯區別，模型組出現了明顯肺泡及肺間質水腫、出血、炎性細胞聚集的炎癥表現。模型組血液PEA DNA表達在接種后第3、7、11天均明顯高于定植組，二者比較存在統計學意義（P均＜0.01）。結論 血清檢測有助于對銅綠假單胞菌感染與定植的鑒別診斷，且可預測肺部炎癥的程度及預后。

銅綠假單胞菌外毒素；實時熒光定量PCR；感染；定植

銅綠假單胞菌外毒素A（P aeruginosa ExotoxinA，PEA）是銅綠假單胞菌的主要致病物質，通過抑制細胞的蛋白質合成而導致細胞死亡，95 %以上臨床分離PA都會分泌這種毒素[1]，其基因高度保守[2]，鑒于PEA具有高表達及高度保守性，本實驗通過制作大鼠肺部感染及咽部定植模型并檢測血液中PEA表達量的差異，為臨床上銅綠假單胞菌的感染和定植的鑒別提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 清潔級健康雄性SD大鼠180只，體質量200～250 g。

1.1.2 PA菌株：由本學院檢驗科提供分離出的標準銅綠假單胞菌株，用分光光度比色法配成2個麥氏單位濃度 （6×108cFu/mL）。

1.1.3 引物的設計與合成參照GenBank公布的序列：上游引物：5CGAACCTTGGCAGTCTCCTA3：下游引物：5CCGGACCA CTTACACCGATC3。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立：所有動物均事先應用地塞米松抑制免疫3 mg/（kg·d），皮下注射，每日1次，連用7 d。將180只SD大鼠隨機分為三組（每組各60只），即模型組：從氣管內注入0.4 mL銅綠假單胞菌混懸液（2個麥氏單位濃度 6×108CFU/mL）；對照組：從氣管內注入0.4 mL生理鹽水；定植組：從鼻腔、咽部滴入相同的菌液濃度0.2 mL。

1.2.2 取材

分別于接種后第3、7、11天取材，經腹腔注射2 %苯巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，心臟采血方法處死，無菌取出肺組織。

1.2.3 組織病理學檢查：取出右側肺組織，10 %福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片HE染色，光學下觀察。

1.2.4 肺細菌學檢查：將左側肺組織勻漿行培養，取0.1 mL稀釋并涂盤培養，計數菌落。

1.2.5 熒光實時定量PCR檢測：①提取左側肺組織勻漿DNA；②FQ2 PCR反應體系定量檢測DNA。

1.2.6 使用SPSS13.0軟件對數據進行處理，數據用均數±標準差（）表示，統計學方法采用重復測量方差分析進行統計描述。P＜0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1 細菌培養結果：模型組在接種后第3、7天PA菌落數均＞106cfu/mL，第11天＞104cfu/mL；定植組咽拭子在第3、7天培養均能見大量PA生長，第11天細菌數量較前有所減少；定植組及對照組肺組織未見PA菌生長。2.2 肺組織病理學：光鏡下，對照組肺組織結構正常，定植組與對照組無明顯區別，未見明顯的肺泡間隔水腫、炎性細胞浸潤。模型組在3個時間點均有明顯病理改變，在接種后第3天都出現了明顯肺泡及肺間質水腫、出血、炎性細胞聚集的炎癥表現；第7天炎性細胞浸潤有所減少，肺泡水腫減輕；第11天炎性細胞較前明顯減少，淋巴細胞出現，肺泡腔擴大，間隔增寬。

2.3 FQ-PCR目的片段擴增

2.3.1 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1所示，可以觀察到位于200 bp與150 bp間有一特征條帶，無其他非特異性擴增的條帶。

2.3.2 標準曲線的繪制：梯度稀釋DNA模板，在Rotor-Gene 3000上進行SYBR Green I熒光定量PCR，軟件自動生成擴增曲線（如圖2）和標準曲線。由構建的標準曲線可見，起始模板濃度與CT值間有良好的線性關系（R2分別為0.9992、0.9989）。

圖1 PEA基因片段pcr擴增

圖2 PEA擴增曲線

3 討 論

由于本實驗中使用免疫抑制劑，使進入肺內的細菌不斷繁殖及毒素產生，引起組織破壞嚴重。接種后第3天細菌數量多、毒力強，機體免疫功能低下，以多核白細胞浸潤為主。多核白細胞是PA肺部感染早期主要的炎性細胞，其在清除病原體的同時也導致肺損傷。同時肺部PA感染時，能誘導體內炎性細胞因子表達增加，引起趨化肽釋放，細胞因子有相互促進的作用，升高的細胞因子又加重肺組織損傷，還可使內皮細胞活化而導致血管通透性增加，肺泡腔內炎性滲出增加，使炎性反應鏈增強，細菌及毒素入血增加進一步刺激細胞因子分泌，加重肺部炎癥。隨著時間延長，被抑制的免疫逐漸恢復，PA在體內被吞噬細胞清除，使存留在肺內的細菌數量減少，肺部炎癥減輕同時炎性細胞因子釋放減少，肺部損傷減輕，故在感染后第7天PEA DNA的表達量較第3天降低，第11天最低。因而我們可以檢測PEA DNA的水平，依靠這種差異有助于銅綠假單胞菌感染與定植的鑒別。由此我們通過檢測PEA DNA表達量的不同可以將感染與定植區分開，為臨床鑒別診斷PA感染及定植提供有力的實驗依據。

[1] 佟 偉,吳囡,李會.銅綠假單 胞菌外毒 素A原核表 達載體 的 構建 及鑒定[J].現代預防醫學,2008,35(12):2317-2318.

[2] 郭生玉,李勝岐.銅綠假單 胞菌感染豚鼠后生物 被 膜形成的研 究[J].中華微生物和免疫學雜志,2003,23(4):292-295.

Study on PEA in the Blood in Detection and Differential Diagnosis of PA Infection and Colonization

FU Yu-qiong, ZHOU Wei, XIONG Bin, ZHAN Xiao-qin*
(Department of Respiratory Medicine, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

Objective To investigate the pseudomonas aeruginosa exotoxin (PEA) in pseudomonas aeruginosa lung infection, and the clinical value of engraftment expression differences. Methods 180 SD rats, were randomly divided into PA(pseudomonas aeruginosa) infection model group, PA pharyngeal engraftment group and normal saline control group. Observation of PA infection and engraftment of PEA changes of blood. Results The structure of normal lung tissue, engraftment group and the control group, no significant difference between model group and there is an obvious alveolar pulmonary interstitial edema, hemorrhage and inflammatory cell aggregation of inflammation. Model group blood PEA DNA expression in 3, 7, 11 days after inoculation were significantly higher than that of engraftment group, which shows there is statistical significance(P＜0.01). Conclusion Serum helps to pseudomonas aeruginosa infection and engraftment, the differential diagnosis of the degree and the prognosis of lung inflammation and predictable.

Pseudomonas aeruginosa exotoxin; Real-time fluorescent quantitative PCR; Infection; Engraftment

R563.1

：B

：1671-8194（2014）01-0010-02

*通訊作者:E-mail: 490546615@qq.com