三七總皂苷抑制毒胡蘿卜素誘導Bip/GRP78和caspase-12的表達

余 晶* 邱 華 龍福立 石清蘭 陳月橋 毛德文

（廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病科，廣西 南寧 530023）

三七總皂苷抑制毒胡蘿卜素誘導Bip/GRP78和caspase-12的表達

余 晶* 邱 華 龍福立 石清蘭 陳月橋 毛德文

（廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病科，廣西 南寧 530023）

目的 探索三七總皂苷在內質網（ER）應激條件下的細胞保護作用，分析三七總皂苷的抗肝細胞凋亡作用的機制。方法 毒胡蘿卜素（TG）誘導人類肝臟來源的細胞株Huh7細胞形成內質網應激介導的細胞凋亡。設置空白對照，三七總皂苷，毒胡蘿卜素，及三七總皂苷加毒胡蘿卜素不同處理細胞，加入細胞培養TG濃度5 μmol/L，三七總皂苷濃度150 μmol/L，培養24 h。熒光顯微鏡觀察細胞形態學形態學，流式細胞儀測定細胞凋亡，免疫印記法檢測Bip/GRP78和pro caspase-12，細胞caspase-3/7活性分析。結果 毒胡蘿卜素處理細胞染色質固縮，向外周聚集，周邊化。形成很多顆粒物質。大量細胞核破裂形成碎片，核解體。三七總皂苷共同處理的細胞改善了細胞器的完整性，減少形態學改變，DAPI染色顆粒物質減少了45 %。流式細胞儀測定顯示三七總皂苷處理減少了2.5倍毒胡蘿卜素引起的細胞凋亡。三七總皂苷減少TG誘導內質網應激標志物Bip/GRP78產生，降低pro caspase-12向caspase-12轉化。減少caspase-3/7活性50 %。結論 三七總皂苷具有細胞保護作用，對抗內質網應激介導的細胞凋亡。三七總皂苷的抗凋亡作用的機制與穩定內質網內環境，抵消TG-誘導的內質網應激Bip/GRP78產生，降低pro caspase-12向caspase-12轉化有關。這些研究結果有助于我們了解三七總皂苷對內質網應激相關的肝臟疾病的治療作用機制。

三七總皂苷；內質網應激；Bip/GRP78

內質網（ER）是一種重要的真核細胞器，由于各種原因引起的內質網中出現錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態，稱為內質網應激（ERS）。內質網應激是誘導肝損傷導致凋亡途徑之一。研究表明脂肪肝、膽汁淤積和酒精性肝病，病毒性肝炎等的發病機制均與內質網應激引起的肝細胞凋亡有關[1]。田七是產于廣西的中藥，中醫認為田七具有活血化瘀，消腫止痛，止血等功能。田七的主要活性成分為三七總皂苷（PNS）。三七總皂苷已廣泛應用于治療心腦血管疾病。藥理研究發現，除了其對心腦血管系統疾病具有治療作用外還具有治療慢性肝炎的作用。但是它的作用機制并未完全了解，本研究從分子生物學的角度探索三七皂苷對內質網應激引起的肝細胞凋亡的作用及其作用機制。毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）是一種內質網特異的鈣離子ATP酶抑制劑，用于建立內質網應激介導細胞凋亡的實驗模型[2,3]。毒胡蘿卜素通過抑制內質網膜鈣離子APT酶，干擾內質網鈣離子穩定， 鈣離子從內質網外流，形成內質網應激。本研究主要觀察三七皂苷保護肝細胞的具體作用環節，發現三七皂苷對內質網應激導致肝細胞凋亡信號傳導通路的影響位點。為中藥治療肝臟疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 三七總皂苷及毒胡蘿卜素

三七總皂苷（昆明制藥集團股份有限公司，批號：20090701），毒胡蘿卜素購買于美國Sigma公司。三七總皂苷溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，三七總皂苷儲存液的濃度為100 mmol/L，儲存于-20 ℃備用。30 %的毒胡蘿卜素在每次使用前用無菌水稀釋。

1.2 細胞培養及分組處理

人體肝臟衍生的細胞系Huh7細胞在最低必需培養基（MEM），在含10 %胎牛血清（FBS），1 %青霉素G鈉，硫酸鏈霉素，二性霉素。增濕培養箱中，將細胞培養在37 ℃和5 % CO2。24 h后，將培養基更換為不含FBS的MEM。為了探討三七總皂苷是否發揮細胞保護作用，細胞治療與三七總皂苷濃度從10 μmol/L到300 μmol/L過夜，然后細胞暴露于TG（5 μmol/L）24 h，如以前的實驗顯示，這種條件可以誘導內質網應激[2]。設定無細胞空白對照，細胞未處理對照，三七總皂苷處理，毒胡蘿卜素處理，和三七總皂苷加毒胡蘿卜素處理5組。

1.3 儀器

ST-360自動酶標儀（上海科華實驗系統有限公司）；311二氧化碳培養箱（美國ThermoForma公司產品）；DLF560型超凈工作臺（荷蘭clear Air Techniek bv公司產品）；細胞培養瓶（加拿大 BIOFIL 公司產品）；96孔板（加拿大 BIOFIL 公司產品）；熒光相差顯微鏡（德國萊卡儀器有限公司）；微量移液器（法國Pipetman公司產品）；TB-215丹佛精密天平（德國賽多利斯儀器系統有限責任公司）。流式細胞儀（BD FACSCalibur機型）。

1.4 方法

1.4.1 細胞形態學形態學檢查

經細胞培養及分組處理后，0.2 μg/mL 4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在熒光相差顯微鏡進行形態學檢查。

1.4.2 流式細胞儀對凋亡細胞測定

運用Annexin V/PI雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司生產，貨號：V13241）按試劑盒的操作指導，細胞收集：將經過50 μg/mL三七總皂苷及TG處理的細胞直接收集到10 mL的離心管中，每樣本細胞數為（1～5）×106/mL 500～1000 r/min離心5 min，棄去培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，500～1000 r/min離心5 min。用100 μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min。500～1000 r/min離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不時振動。在每次處理后，含有分離的細胞和殘留的貼壁細胞的上清液，用冷PBS洗滌，用胰蛋白酶/EDTA收獲，在室溫下在黑暗中加入Annexin V-FITC和PI并孵育10 min。Annexin V-FITC結合流式細胞儀（前488 nm；EM 530 nm）的藻紅蛋白的發射信號檢測使用FITC信號探測器和碘化染色。每個樣品計數細胞后，定量分析凋亡性細胞死亡的百分比。每個象限染色細胞百分比量化使用軟件分析熒光的分布顯示為散點圖，測定熒光的細胞的百分比在每個象限。這種方法用于區分完好的活細胞（FITC-/PI-），凋亡細胞（FITC+/PI-）和晚期凋亡/壞死細胞（FITC+/PI+）。

1.4.3 半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3/7）活性分析

細胞半胱氨酸蛋白酶活性熒光定量檢測試劑盒（上海寶曼生物公司科技有限公司 GMS50030.1，GMS50346.2），按試劑盒的操作指導，細胞按7×104/mL接種于黑色96孔板，設定無細胞空白對照，細胞未處理對照，150 μg/mL三七總皂苷處理，TG處理，和三七總皂苷加TG處理組，每組8個復孔。三七總皂苷提前孵育3 h后加入TG孵育48 h，培養終止加入AMC Caspase-3/7活性測定液，每孔50 μL，避光室溫100 r/min搖動1 h后，用熒光分光光度計在Ex 345 nm/Em 442 nm測定熒光強度，熒光強度代表樣品中存在的活性caspase-3/7的量。

1.4.4 免疫印跡試驗

細胞以3×106個/mL的濃度接種于4個10 cm直徑培養器中。設定細胞未處理對照，150 μg/mL三七總皂苷處理，5 μmol/LTG處理，和三七總皂苷加TG處理4組。三七總皂苷提前孵育3 h后加入TG 24 h。處理結束，收細胞，提蛋白，測蛋白濃度，取等量蛋白上樣，裂解物中的蛋白濃度的測定使用BCA蛋白檢測試劑盒。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并轉移到硝酸纖維素膜。1抗體孵育，清洗，免疫反應檢測順序辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，ECL化學發光。X線膠片感光顯影。印跡Pro-caspase 12，Bip/GRP78，β-actin作為上樣均等標記。

1.4.5 統計分析

所有本文顯示數據都經過三次以上獨立試驗取得相似結果。計量數據以均數±標準差表示。比較兩組間差異顯著行用t檢驗。P＜0.05為統計學上差異有顯著性。

2 結 果

2.1 三七總皂苷抑制TG誘導Huh7細胞凋亡

我們進行細胞增殖檢測。細胞增殖TG曝光后，下降至49.3 %。但是，這種減少被逆轉細胞的增殖與三七總皂苷（10～300 μg/mL）的預處理。在150 μg/mL的三七總皂苷表現出最好的效果，對TG誘導的細胞死亡，所以三七總皂苷150 μg/mL的選擇最佳劑量探討三七總皂苷的抗凋亡作用在實驗[4]。細胞形態學形態學檢查發現，正常對照的細胞核：核形完整，染色質均勻。毒胡蘿卜素處理細胞染色質固縮，向外周聚集，形成周邊化。形成很多顆粒物質。大量細胞核破裂形成碎片，核解體。三七總皂苷共同處理的細胞改善了細胞器的完整性，減少形態學改變，DAPI染色顆粒物質減少了45 %（圖1）。

圖1 DAPI染色觀察三七總皂苷對TG誘導Huh7細胞凋亡的影響

流式細胞儀分析顯示，TG處理24 h后，Annexin V和PI雙陽性細胞的數量顯著增加，然而，三七總皂苷共同處理的細胞這種細胞凋亡的細胞減少了2.5倍（圖2）。三七總皂苷減少細胞死亡水平，Annexin V的陽性細胞減少了1.5倍，PI陽性細胞減少2倍。

圖2 流式細胞儀分析三七總皂苷對TG誘導的細胞凋亡的影響

2.2 三七總皂苷對內質網應激信號的影響

2.2.1 三七總皂苷抑制TG誘導Bip/GRP78

Bip/GRP78是內質網應激發生的指標，提示去除蛋白折疊反應正在被觸發。如圖3所示，與TG的處理后的Bip/GRP78蛋白的表達量增加。與三七總皂苷預處理抑制TG誘導Bip/GRP78的至少50 %。

圖3 三七總皂苷對ER應激信號的影響

2.2.2 三七總皂苷抑制TG誘導的caspase-12的激活

TG是內質網Ca2+-ATP酶抑制劑。內質網Ca2+的波動激活Huh7細胞內的Pro-caspase-12向caspase-12轉化。我們研究了三七總皂苷對TG誘導caspase12活化的影響。免疫印記分析表明TG處理細胞導致Pro-caspase-12的明顯減少。然而預先用150 μg/mL的三七總皂苷降低TG誘導活化的caspase-12，抑制了Pro-caspase-12向caspase-12轉化（圖3）。

2.2.3 三七總皂苷抑制TG誘導的caspase3/7的激活

通過測量caspase3/7活性，我們研究了三七總皂苷對TG誘導蛋白酶3/7的激活的影響。 TG處理24 h后，與未處理的細胞相比caspase-3/7活性增加超過5倍。三七總皂苷處理后抑制的caspase-3/7活性的至少50 %（圖4）。

圖4 三七總皂苷抑制TG誘導的caspase3/7的激活（對照（C），三七總皂苷（PNS），毒胡蘿卜素（TG））

3 討 論

內質網承擔新生蛋白質的折疊、組裝和轉運。在蛋白質折疊過程中，由于各種原因會使得未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白增多。然而，在細胞內存在一種機制，這一機制可以通過調整內質網折疊蛋白的數量和加強內質網的折疊能力，來減少未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的進一步生成，緩解內質網壓力，當缺乏分子伴侶或細胞能量，氧化還原環境破壞，蛋白質變異，Ca2+外流，可以干擾內質網功能，形成應激，導致細胞信號通路的激活被稱為去蛋白折疊反應（unfolded protein response，UPR）。GRP78是一種內質網分子伴侶蛋白，是細胞為了適應內質網應激狀態所產生的一組應激蛋白，GRP78結合Ca2+保護細胞免受錯誤折疊的蛋白質在內質網中的有害影響，內質網內調整去蛋白質折疊反應，細胞避免死亡；在應激調節時其基因的轉錄活性提高，過度GRP78表達從而維持了內質網的Ca2+穩定及內環境穩定，轉移內質網腔內的錯誤折疊蛋白，保持細胞在應激狀態下蛋白質繼續合成，降低因Ca2+的波動而引起的細胞死亡[5]。然而，蛋白質錯誤折疊是持久或過度時，內質網應激觸發細胞死亡。內質網應激反應也可以導致ROS的產生，這也可以積累后發生折疊蛋白在內質網。線粒體活性氧也可以作為質網應激誘導的Ca2+釋放和內線粒體膜的去極化作用的結果產生的。因此，氧化應激相關的內 質網 應 激造 成 多途 徑的細 胞死 亡[6,7]。 三 七總 皂苷減 少Huh7細胞毒胡蘿卜素誘導的ROS生成[4]。因此，三七總皂苷細胞保護作用是從多方面進行。Pro-caspase 12是caspase 12蛋白酶前體（相對分子質量約60×103），主要存在于內質網，內質網損傷可特異性地介導其活化。非內質網應激所致凋亡不會引起caspase 12的活化，有實驗用免疫印跡法檢測TG誘導小鼠肝細胞凋亡過程中caspase 12的活化，結果發現，TG誘導12 h pro-caspase 12表達增高，可能是由于受到TG刺激后細胞作出的生理反應性增高。在18 h以后隨著細胞進展至凋亡，細胞內pro-caspase 12被切割形成活化的caspase 12而逐漸減少[8]。這與本實驗結果一致。

我們的研究結果表明，三七總皂苷對TG誘導的細胞內質網應激，信號通路激活形成凋亡具有細胞保護作用。三七總皂苷誘導的細胞保護作用是與穩定內環境，抑制TG誘導內質網應激，減少procaspase-12的轉化，抑制下游信號蛋白酶caspase3/7的激活。

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R285.5

：B

：1671-8194（2014）01-0049-03

廣西壯族自治區科學技術廳廣西科學基金項目（合同編號：桂科回0991010）

*通訊作者:E-mail: jingy1237@126.com