靶向Akt1基因RNA干擾對胸主動脈平滑肌細胞增殖的影響

劉蘇健 范波 丁明超 王意忠 王斌

近年來，動脈硬化及其閉塞性血管疾病的發生率迅速升高，自體靜脈移植是治療外周血管疾病的有效手段。然而移植血管中膜平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向內膜遷移、過度增殖和細胞外基質大量合成是導致血管移植術后移植靜脈內膜增厚、管腔狹窄的重要原因［1］。如何防治血管內膜增生一直是困擾血管外科醫師的臨床難題。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是在轉錄后水平使得靶基因mRNA降解，從而使得目的基因表達減少或沉默［2］。本研究針對PI3K-Akt-mTOR信號通路中關鍵信號因子Akt亞型Akt1進行RNA干擾，通過分子生物學技術觀察其抑制平滑肌細胞增殖的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 質粒pGenesil-1和感受態大腸桿菌DH-5α購自武漢晶賽生物技術有限公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，DMEM培養基(Dulbcco's Modified Eagle Medium)和新生牛血清購自美國Gibco公司，限制性核酸內切酶BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、PstⅠ和T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司，質粒小提試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Annexin V-PE購自Bender Medsystems公司。

1.2 方法

1.2.1 基因序列:利用Invitrogen網站(www.invitrogen.com)提供的設計工具設計目的靶基因兔Akt1 mRNA序列，依照shRNA設計原則，設計并合成4條shRNA片段，退火形成雙鏈后進行酶切和測序，經預實驗后挑選出2條有效地Akt1 shRNA真核表達載體，一條為5’-GGGACUAGACCAUAAUCCATA-3’，另外一條為5’-CCTGGCUGACUUGAAUAUGTT-3’，陰性對照(錯配質粒shRNA)序列為5’-UUAGACCUCTGGUUCGUACTT-3’，確保選擇的shRNA與其他基因序列至少存在3個以上的堿基不同［3］。

1.2.2 合成shRNA序列DNA單鏈并測序:每條靶序列設計并合成所編碼shRNA的DNA前向和反向序列單鏈，經退火形成雙鏈后成與相應的黏性末端連接;再次退火連接、載體pGenesil-1質粒線性化處理及回收、稀釋退火片段，用質粒小提試劑盒提取質粒。經測序鑒定無誤后命名為Akt1-shRNA-1和Akt1-shRNA-2。

1.2.3 分組及轉染:該課題設置空白對照組(A組)、陰性對照組(B組)，Akt1-shRNA-1(C組)，Akt1-shRNA-2(D組)。原代培養的第3代日本大耳白兔胸主動脈平滑肌細胞于轉染前1 d接種于6孔板中，用2 ml含10%無抗新生牛血清的培養基定量;置于37℃、5%CO2孵育箱中培養。轉染時，按Lipofectamine2000操作步驟仔細操作，將DNA與Lipofectamine2000溶于無血清無抗的DMEM培養基中，將兩者吹打后混勻;室溫下孵育15～20 min，將混勻的轉染試劑用移液器加入到6孔板中，48 h觀察轉染效率。

1.2.4 FCM檢測細胞凋亡:將原第3代兔胸主動脈細胞接種于6孔板中，細胞爬滿玻璃片后Lipofectamine2000脂質體法轉染細胞:加入結合緩沖液分別兩次懸浮平滑肌細胞，將細胞懸液移入5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-PE和10 μl 7-AAD，室溫孵育15 min后加緩沖液至500 μl;流式細胞儀分析，凋亡細胞所占總細胞比例即為凋亡率，實驗重復三次，分別于轉染后24、48、72、96 h處理細胞。

1.2.5 TUNEL檢測平滑肌細胞凋亡程度:將細胞接種于6孔板中，置孵育箱中培養，使細胞密度達到90%～100%。Lipofectamine2000脂質體法轉染平滑肌細胞，培養6 h后給予換液，按TUNEL試劑盒操作步驟進行操作，分別加入50 μl TUNEL液和50 μl轉化劑-POD，在濕盒中孵育30 min。PBS沖洗3次，加入200 μl DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次后封片，在光鏡下分析結果。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔平滑肌細胞原代培養 原代培養5～7 d后給予更換DMEM培養液，可見少量平滑肌細胞從組織塊邊緣游出(圖1);10～13 d可見組織塊邊緣有明顯的平滑肌細胞聚集，細胞呈帶狀、長梭狀(圖2);采用α-SM-actin對兔原代培養平滑肌細胞進行細胞學鑒定，見圖3。

圖1 原代培養5 d的平滑肌細胞，可見組織塊邊緣有小的平滑肌細胞游出

圖2 培養12 d的平滑肌細胞，呈現特征性“峰”“谷”生長

圖3 α-SM-actin染色，陽性呈棕黃色(TUNEL×400)

2.2 兔平滑肌細胞轉染效率 質粒轉染第3代平滑肌細胞于48 h后在熒光顯微鏡下觀察，兩人分別同時計數相同視野下綠色熒光細胞與光學顯微鏡下細胞總數，重復三次后取其平均值。見圖4。

圖4 平滑肌細胞轉染48 h熒光照片，轉染細胞呈綠色，48 h轉染率為17.8%(TUNEL×200)

2.3 流式細胞儀計算細胞凋亡數目 實驗結果表明24 h Akt1-shRNA-1和Akt1-shRNA-2組細胞凋亡率分別為15.97%和12.47%，在48 h凋亡率分別達到19.72%和15.43%，抑制增殖效果達到最高峰，轉染組與對照組相比有統計學差異(P＜0.05)，之后抑制增殖效果趨于平緩;A組與B組相比凋亡細胞數目差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖5、6。

2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡數目Lipofectamine2000脂質體法轉染第3代兔胸主動脈平滑肌細胞，轉染后48 h用多聚甲醛固定平滑肌細胞，TUNEL法檢測細胞凋亡，轉染組與對照組相比細胞凋亡明顯增多(P＜0.05)。TUNEL結果顯示C組和D組均促進凋亡的發生，以C組較為明顯。見圖7、8。

圖5 各時間點流式細胞術檢測細胞凋亡直方圖，A為空白對照組、B為陰性對照組，C為Akt1-shRNA-1，D為Akt1-shRNA-2。*為與A組和B組相比P＜0.05，各時間點A組與B組相比無統計學意義(P＞0.05)

圖6 流式細胞術檢測48 h細胞凋亡示意圖

圖7 兔血管平滑肌細胞質粒轉染48 h結果(TUNEL×100)

圖8 TUNEL檢測凋亡直方圖。A為空白對照組、B為陰性對照組，C為Akt1-shRNA-1，D為Akt1-shRNA-2

3 討論

隨著社會的發展，血管閉塞性疾病越來越給老年患者帶來痛苦，而除介入操作外血管搭橋術可解決血管外科大部分疾病的困擾，而血管移植術后再狹窄的主要原因之一是血管中膜平滑肌細胞的增殖和向內膜遷移［2］。新生內膜增生開始于靜脈移植術后的早期，并最終可能導致移植血管管腔狹窄或閉塞［3］。血管移植術后移植血管再狹窄的發生機制十分復雜，多種細胞因子、生長因子、血管活性物質參與已得到證實［4，5］。PKB(Akt)是PI3K-Akt-mTOR信號通路系統中一個重要信號位點，是調節細胞增殖和凋亡的重要信號分子;Akt家族包括Aktl，Akt2，Akt3三個亞類，它們的結構相似但功能截然不同，Aktl可能參與調控細胞生長和生存［6］。激活的Akt通過促進下游靶位點如(mTOR)等磷酸化而發揮其廣闊的生物學效應。通過影響信號通路來防治VSMC的增殖和促進其凋亡是近年來血管外科領域基因研究的熱點。

RNAi技術有其獨特的優點即高效性、高特異性和可遺傳性。目前已進行的一些哺乳動物細胞實驗中應用RNAi技術表明其可有效地抑制細胞靶基因的表達。目前尚未見有關利用RNAi技術抑制Akt1基因表達的文獻報道。本課題組應用RNAi技術抑制VSMCs Akt1基因的表達。通過Lipofectamine2000將shRNA轉染入原代培養的兔胸主動脈平滑肌細胞內，利用熒光顯微鏡觀察其轉染效率，結果顯示脂質體成功地將shRNA轉染入原代培養兔胸主動脈平滑肌細胞內，48 h轉染率為17.8%;應用流式細胞術于24、48、72、96 h檢測shRNA抑制平滑肌細胞增殖，結果顯示shRNA轉染后試驗組細胞凋亡數目增加，48 h凋亡率最高，之后隨著時間延長凋亡細胞逐漸減少。上述結果分別從蛋白和細胞水平驗證了針對Akt1的shRNA有效地抑制了兔原代培養血管平滑肌細胞的增殖，為下一步試驗奠定了基礎。

1 Payeli SK，Latini R，Gebhaed C，et al.Prothrombotic gene expression profile in vascular smooth muscle cells of human saphenous vein，but not internal mammary artery.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28:705-710.

2 Werth D，Grassi G，Konjer N，et al.Proliferation of human primary vascular smooth muscle cells depends on serum response factor.Eur J Cell Biol，2010，89:216-224.

3 劉蘇健，劉宏，趙京，等.大鼠Pik3cb短發卡狀RNA對平滑肌細胞增殖的影響.南京醫科大學學報.2008，28:1234-1239.

4 Scott NA.Restenosis following implantation of bare metal coronary stents:pathophysiology and pathways involved in the vascular response to injury.Adv Drug Deliv Rev，2006，58:358-376.

5 Chapman MJ.From pathophysiology to targeted therapy for atherothrombosis:A role for the combination of statin and aspirin in secondary prevention.Pharmacol Ther，2007，113:184-196.

6 Song G，Ouyang G，Bao S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and survival.J Cell Med，2005，9:59-71.