黃芪多糖對免疫功能影響的體外實驗研究

劉印華 李樹義 趙志強 張慶波

黃芪桂枝五物湯載于《金匱要略·血痹虛勞病脈證治》，該方由黃芪、芍藥、桂枝、生姜、大棗五味藥組成，具益氣溫經、和營通脈之功［1］。原方主要是治療血痹，而現代臨床應用已遠遠超越了原方“血痹”癥的范疇，尤其是在治療類風濕性關節炎、微循環障礙和腦中風后遺癥等方面，收到滿意的療效［2］。長期以來備受中醫學者青睞，是臨床常用經典名方之一。黃芪是黃芪桂枝五物湯中的主要成分之一，黃芪多糖具有多種重要的生物學作用，包括對免疫功能的影響，但黃芪多糖對機體免疫功能影響的系統研究，經河北省醫學情報研究所查新(編號:13010520130618)目前在國內外尚未見文獻報道。本項目將通過小鼠脾細胞體外實驗，系統研究黃芪多糖對免疫功能的影響，為臨床應用和相關產品的開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪多糖:由河北聯合大學藥學院提供。測增殖用試劑WST-1:購于江蘇碧云天生物科技公司。

1.2 實驗用動物 取4～6周齡昆明種小鼠，體重(20±2)g，雌雄各半，SPF級，購自北京軍事醫學科學院。(合格證編號:0123883)

1.3 小鼠脾細胞增殖活性的測定 取5周齡小鼠4只，雌雄各2只，頸椎脫臼處死，無菌分別取脾臟，細胞篩研磨成脾淋巴細胞懸液，加入1 ml蒸餾水破碎紅細胞，30 s后加入1.8%氯化鈉溶液，PBS洗細胞3次，計數細胞數，調細胞濃度為1.0×106/ml。在96孔細胞培養板中，每孔加100 μl細胞懸液，10 μl不同濃度的黃芪多糖溶液(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml)，同時設不加黃芪多糖的對照組。每組設3個復孔，置CO2培養箱中分別培養3、6、9 d，用WST-1測OD值，4只小鼠取均值。

1.4 小鼠IL-2，IFN-γ的測定 上述細胞測定增殖前，取上清50 μl置于-80℃冰箱中保存備用。樣品收集完畢后，分別檢測IFN-γ、IL-2的含量(按酶聯免疫試劑盒說明書的要求操作)。

1.5 細胞亞群分析 檢測小鼠脾細胞中CD+3細胞和細胞。取小鼠脾淋巴細胞懸液，以5×106/ml的濃度接種于24孔培養板中，每孔1.5 ml，實驗組加入2.0 mg/ml的黃芪多糖溶液0.5 ml，對照組加入0.5 ml RPMI-1640培養液，培養6 d后，取細胞懸液，1500轉/min，離心5 min;PBS洗滌;加入FITC進行免疫標記反應(100 μl細胞懸液∶100 μl抗體)，避光孵育30 min;PBS洗2次，每管加入200 μl 1%多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 黃芪多糖對小鼠免疫細胞增殖活性的影響 實驗結果顯示黃芪多糖對小鼠脾淋巴細胞有刺激增殖作用，其最佳濃度為2 mg/ml(P＜0.05或＜0.01)。見表1。

表1 黃芪多糖對小鼠免疫細胞增殖活性的影響±s

表1 黃芪多糖對小鼠免疫細胞增殖活性的影響±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

黃芪多糖(mg/ml)3 d6 d9 d 0.47±0.120.86±0.211.11±0.52 0.251.42±0.65*2.54±0.57*2.77±0.73*0.52.78±0.33#3.43±0.36#4.41±0.32#1 3.56±0.66#4.65±0.34#5.52±0.73#2 4.24±0.20#4.87±0.34#6.76±0.56#4 4.31±0.64#4.78±0.39#6.79±0.46 0#

2.2 細胞上清IFN-γ的測定ELISA檢測結果顯示:黃芪多糖組IFN-γ的含量顯著高于對照組(P＜0.05或 ＜0.01)。培養3、6和9 d，的黃芪多糖組以2.0 mg/ml濃度最高，高于此濃度時，其含量不再增加。見表2。

表2 IFN-γ的測定n=4，pg/ml，±s

表2 IFN-γ的測定n=4，pg/ml，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

時間(d)黃芪多糖(mg/ml)0(對照)0.250.5124±3 3.65±0.135.66±1.22*6.78±1.02*7.96±1.56#9.47±1.78#9.66±1.77#5.31±1.249.42±1.78*11.56±1.54#13.48±2.78#17.73±2.89#17.62±2.65#9 9.21±1.7617.34±3.15*20.12±3.45#22.31±3.77#29.55±3.96#29.67±4.63 6#

2.3 IL-2的測定 黃芪多糖組IL-2的含量隨著黃芪多糖濃度的增加而升高，以2.0 mg/ml濃度效果最明顯(P＜0.05或 ＜0.01)。見表3。

表3 IL-2的測定n=4，pg/ml，±s

表3 IL-2的測定n=4，pg/ml，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

時間(d)黃芪多糖(mg/ml)0(對照)0.250.5124 3 4.33±0.216.56±0.33*8.47±2.12*9.63±2.11#12.65±3.24#12.45±2.11#7.21±1.3210.23±3.42#12.89±3.24#16.67±3.78#19.68±5.12#19.44±3.89#9 10.34±3.3517.56±5.21#20.33±5.13#21.23±5.77#32.54±6.87#32.64±5.28 6#

表4 CD3亞群的檢測

表5 亞群的檢測

表5 亞群的檢測

組別 細胞總數標記細胞未標記細胞CD+19細胞占細胞總數的百分比(%)χ2值P值10 0002429 7582.7328.8834＜0.001黃芪多糖組對照組10 0004599 5414.59

3 討論

黃芪桂枝五物湯的藥理學研究主要集中在飲片層次，從整體效果及拆方后藥物的配伍組合，如:王妮等［3］進行了黃芪桂枝五物湯加減，治療血液高粘滯綜合征;馬麗［4］用黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經病變微循環障礙的患者;趙桂華等［5］運用黃芪桂枝五物湯對小鼠的免疫調節作用進行了研究;許利平等［6］對黃芪桂枝五物湯加味的藥效作用研究證實該方有一定程度的鎮痛、抗氧化作用;黃兆勝等［7］對黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮痛的比較研究將該方按藥對研究法拆方分組;施旭光等［8］進行了黃芪桂枝五物湯及其配伍對佐劑性關節炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究;許曉峰［9］等證實黃芪桂枝五物湯有抑制佐劑性關節炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α升高的作用。

對復方中各單味藥化學成分及藥理作用研究，如:黃芪中含有的黃芪多糖、皂苷、黃酮等化合物具有較強的生物活性，黃芪皂苷主要作用于心腦血管，通過擴張血管達到降壓目的;黃芪多糖主要作用于多種免疫活性細胞，促進細胞因子的分泌和正常機體的抗體生成［10］。桂枝的有效成分是揮發油，主要為桂皮醛和桂皮酸，可擴張血管，促進發汗、解熱、鎮痛、鎮靜、利尿［11］。芍藥中的主要有效成分為芍藥總苷，現被廣泛用于治療類風濕關節炎等自身免疫性疾病［12］。大棗中含有多種有效成分，如大棗多糖、黃酮類、皂苷類、三萜類、生物堿類等。大棗多糖是大棗中重要的活性物質，有促進淋巴細胞增殖作用，可提高機體免疫力。大棗中的黃酮類物質對腦缺血所致的腦組織超微結構損傷有保護作用。大棗中所含的皂苷類物質，具有調節人體代謝、增強免疫力、抗炎、抗變態反應、降血糖和膽固醇等作用［13-15］。

黃芪是黃芪桂枝五物湯中的主要有效成分之一，研究結果表明:黃芪多糖能刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，促進細胞因子的分泌。在一定濃度范圍內，隨著黃芪多糖濃度的增加，細胞增殖效果也隨之增加，IL-2和IFN-γ的分泌量亦如此，具有明顯的量效關系。相關研究顯示多糖對B細胞有促進增殖的效果［16］，但對T細胞的作用則取決于多糖種類［17］，本實驗在檢測細胞亞群時發現T、B細胞均有大幅增長，表明黃芪多糖對機體的細胞免疫、體液免疫均有顯著的增強作用。

黃芪多糖的研究較多，但缺乏對其進行系統深入的研究，本項目將對其進行系統深入研究，包括體外研究和體內研究，可望對黃芪的作用有全面了解，以便在臨床得到更好的應用。

1 黃仰模主編.金匱要略講義.第1版.北京:人民衛生出版社，2003.71-72.

2 趙蕊，蔣明.黃芪桂枝五物湯的臨床應用.黑龍江中醫藥，2007，4:60-62.

3 王妮，方瑜，袁有財，等.黃芪桂枝五物湯加減治療血液高粘滯綜合征.陜西中醫學院學報，2007，30:19-20.

4 馬麗.黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經病變微循環障礙的影響.遼寧中醫雜志，2006，33:140-141.

5 趙桂華，唐其風.黃芪桂枝五物湯對小鼠的免疫調節作用.中國冶金工業醫學雜志，2006，23:708-709.

6 許利平，胡曉梅，任桂華，等.黃芪桂枝五物湯加味的藥效學研究.四川生理科學雜志，1999，21:30.

7 黃兆勝，施旭光，朱偉，等.黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮痛的比較研究.中藥新藥與臨床藥理，2005，16:93-96.

8 施旭光，朱偉，黃兆勝，等.黃芪桂枝五物湯及其配伍對佐劑性關節炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究.中藥新藥與臨床藥理，2006，22:3-5.

9 許曉峰，林斌，王沛堅.黃茂桂枝五物湯對AA大鼠血清IL-1β、TNF-α的影響.現代生物醫學進展，2007，7:1202-1204.

10 盧彥琦.黃芪化學成分及藥理作用綜述.保定師范專科學校學報，2004，17:40-42.

11 劉江云.桂枝的化學成分研究.中草藥，2002，33:681-683.

12 鄭輝.白芍總苷的抗風濕藥理作用.浙江中西醫結合雜志，2008，18:520.

13 苗明三，孫麗敏.大棗的現代研究.河南中醫，2003，23:59-60

14 周運峰.大棗多糖抗氧化作用.中西醫結合，1997，(特刊):97-98.

15 崔振環.復方大棗合劑對小鼠乳腺癌生長抑制作用的初步觀察.天津醫科大學學報，1999，5:15-16.

16 楊曉林，孫菊云，張淪.褐藻糖膠的有絲分裂原效應.中華微生物學和免疫學雜志，1991，11:282-284.

17 莊茂辛，吳耀生，李曼玲.黃芪、黨參、人參多糖對豚鼠免疫功能的影響.中國藥學雜志，1992，27:653-655.