臨床分離鮑曼不動桿菌耐消毒劑基因攜帶情況分析及消毒對策

于文靜 聞海豐 秦瑾 馮忠軍

消毒劑常被醫療機構應用于各種醫療設施和環境表面的消毒［1］，在預防和控制病原菌在醫院內的傳播方面起到了重要的作用，但消毒劑的長期廣泛使用有可能使細菌產生對消毒劑環境的適應，導致對消毒劑產生抗性。近年來國內外學者已從多重耐藥鮑曼不動桿菌中檢出攜帶耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1的菌株，且攜帶率較高［2-5］。鮑曼不動桿菌具有極強的環境適應能力和獲得外源性耐藥基因的能力［6］。因此做好鮑曼不動桿菌耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1的監測，了解其對常用消毒劑的抗性，將有助于合理選擇與使用消毒劑，對控制其傳播有重要的意義。本文對臨床分離的73株多重耐藥鮑曼不動桿菌qacEΔ1-sul1基因的攜帶情況及其含氯消毒劑的耐受狀態進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 試驗菌株分離自河北醫科大學第三醫院2012年10月至2013年6月住院患者及其住院環境的送檢標本(排除同一患者重復分離菌株)，其中男50例，女19例;年齡1～89歲。標本來源主要為:痰液37株、血液5株、傷口分泌物22株、ICU環境表面分離4株，尿液、導管、腹水、腦脊液、咽試子各1株。標本來自科室主要是ICU 29株，創傷急救中心11株，急診科7株，其余菌株分布在不同的科室。全部菌株均符合多重耐藥菌的標準，經ID32E鑒定試劑卡鑒定后，采用濾紙保存法，凍存于-80℃備用。

1.2 主要儀器與試劑ABI7300型熒光定量PCR檢測儀為美國生物應用公司產品，腸桿菌科和其他非苛氧革蘭陰性鑒定試劑為由法國生物梅里埃公司產品，DNA Marker 1由廣東東盛生物技術有限公司提供，綠色體系［Green PCR Master Mix(2x)］由Fermentas提供，核酸染料GoldViewⅠ由北京索萊寶科技有限公司提供;含氯消毒劑為泡騰消毒片Ⅱ型，主要成分為三氯異氰尿酸，由山東利爾康消毒科技股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備:在含有菌株的EP管中加入2 ml營養肉湯，孵育過夜，后接種到哥倫比亞血瓊脂培養基上，孵育過夜后取典型的菌落，懸浮于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中，配制成0.5麥氏濁度的菌懸液備用。

1.3.2 藥敏試驗:采用紙片擴散法測定13種抗菌藥物的敏感性，包括哌拉西林、頭孢他啶、亞胺培南、頭孢哌酮、頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。由溫州市康泰生物科技有限公司提供，質控菌株為大腸桿菌ATCC25922，根據美國實驗室標準化研究所(CLSI)2010年版進行抗菌藥物敏感性判斷。

1.3.3 耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1檢測qacEΔl-sul1基因引物序列［6］如下:P1:5’-TAGCGAGGG CTTT ACTAAGC-3’，P2:5’-ATTCAGAATGCCGAACACCG-3’，PCR擴增后陽性產物長度為300bp。引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。細菌基因組DNA提取試劑盒由北京康為世紀生物技術有限公司提供;PCR擴增反應體系如下:P1引物2 μl(10 μmol/L)、P2引物2 μl(10 μmol/L)，PCR反應液Green PCR Master Mix(2x)25 μl、模板3 μl、超純水18 μl，總反應體積50 μl。PCR熱循環參數為:95℃預變性2 min，然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共進行35個循環，最后72℃延伸5 min。取5 μl擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳35 min，電壓100 V，出現與陽性對照分子相當的目的條帶判為陽性，并拍照保存。

1.3.4 消毒劑敏感性檢測:對73株鮑曼不動桿菌進行最小抑菌濃度(MIC)按《消毒技術規范》(2002年版)規定的最小抑菌濃度測定實驗(營養肉湯稀釋法)進行檢測。取一片消毒片有效氯濃度為500 mg/L放入到500 ml蒸餾水中，配成濃度為1 000 mg/L的消毒液，然后將消毒液稀釋成500 mg/L、400 mg/L、300 mg/L、250 mg/L。分別將2.5 ml不同濃度的消毒液加到無菌試管中，再向各管中加2.5 ml的雙倍營養肉湯。最后在管中加入70 μl(1.5×108cfu/ml)菌懸液混勻，使其含菌量為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。將試驗菌、陽性對照及陰性對照試管放置37℃培養箱中，培養48 h，觀察結果。無細菌生長的最高稀釋度所對應的抗(抑)菌劑濃度為消毒劑判為受試菌的MIC。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果73株鮑曼不動桿菌對13種抗菌藥物的藥敏結果 見表1。

表1 73株鮑曼不動桿菌對13種抗菌藥物的藥敏試驗結果株(%)

2.2 耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1檢測結果73株鮑曼不動桿菌中37株qacEΔ1-sul1基因陽性，陽性率為50.68%。見圖1。

圖1 耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1檢測結果

2.3 MIC檢測結果 含氯消毒劑對鮑曼不動桿菌的平均MIC值為365.07 mg/L。見表2。

表2 鮑曼不動桿菌對含氯消毒劑MIC測定結果

3 討論

近年來鮑曼不動桿菌的耐藥性日益增強，可以通過固有的耐藥基因或獲取外源基因元件如質粒、整合子、轉座子或耐藥基因島使其成為多重耐藥或泛耐藥的菌株［7］，給臨床治療帶來極大的困難。本研究結果顯示臨床分離的菌株除對頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性為21.91%以外，對其他抗菌藥物的耐藥率高達86.30%～97.26%，可見臨床分離的鮑曼不動桿菌耐藥情況嚴重。在分離的73株鮑曼不動桿菌中，有29株分離自ICU病房，11株分離自骨科創傷急救病房，在這些病房中病人的免疫力低下，且接受侵入性操作，更增加了鮑曼不動桿菌感染的機會。對于多重耐藥菌的感染患者，臨床除了使用抗菌藥物治療之外，各種消毒劑的使用也是非常有效的控制措施。

研究表明，隨著消毒劑大量廣泛的應用，由于往往存在有機物(血、組織、體液、脂質等)干擾，常導致細菌反復接觸亞致死量消毒劑，部分病原菌出現對某些消毒劑的敏感性降低甚至耐藥的情況，這與耐抗生素菌株一樣，抗消毒劑菌株的出現可能將會導致醫院消毒的失敗［8-10］。其原因有細菌細胞外層結構特點或化學組成(外膜蛋白和脂多糖等)引起的對某些消毒劑的天然抗性;有的細菌則可因細胞基因的改變(質粒通過攜帶專門的抗性基因而介導)可產生獲得性抗力;也可能由于消毒劑選擇壓力導致突變株的出現。細菌耐消毒劑主要為獲得qac基因所致。qac基因表達多種消毒劑化合物外排泵蛋白，獲得qac基因可表現為對胺類、胍類、腙類消毒劑耐藥。目前已發現的qac基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacE△1、qacF、qacG、qacH、qacJ等10種［10］。

鮑曼不動桿菌作為臨床主要病原菌之一，其對消毒劑敏感性降低的報道不一［1，11，12］，但耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1的攜帶率較高，本研究中幾乎一半菌株攜帶此基因，與文獻中報道［5，6］的基本一致。細菌對消毒劑產生抗性有可能會對細菌的抗生素耐藥產生影響。含氯消毒劑為一種高效消毒劑，可殺滅包括細菌芽孢在內的所有微生物。醫院中一般污染物品和環境物體表面消毒都采用有效氯為250～500 mg/L，本研究采500、400、300、250 mg/L不同濃度梯度的消毒劑對鮑曼不動桿菌進行消毒劑耐藥性監測，結果表明殺菌效果良好。消毒劑的大量使用會導致細菌對消毒劑的敏感性降低，但是消毒劑耐藥細菌在自然界的水平很低，并且對消毒劑耐藥的濃度也遠低于在醫院、家庭和工業等環境中的正常使用濃度。臨床不規范使用消毒劑和未妥善保存消毒劑可能使消毒劑有效成分降低，因此在臨床實際工作中應根據菌株種類選擇合適的消毒劑，以免受先天抗性的影響。而且在應用消毒劑時，以大劑量一次將菌全部殺死為宜。另外，選擇壓力在細菌對消毒劑抗性中的作用也不容忽視。

雖然抗生素和消毒劑對細菌的作用靶位、殺菌效果、性能和臨床應用方面有所不同，但也存在很多相似之處:通過被動擴散作用穿過細菌包膜，影響膜的形態和完整性，影響細菌的代謝過程(核酸的復制、轉錄、翻譯，物質的轉運和各種酶的活性)。細菌對抗生素和消毒劑也表現出相似的防御機制，例如通過滲透性改變、外排作用、形成生物膜和對抗生素和消毒劑進行轉化，通過基因突變或獲得可移動的基因元件(如轉座子、質粒)編碼耐藥物質(酶、轉運蛋白)。抗生素耐藥和消毒劑耐藥存在共同的調節通路。多數主動外排泵為廣譜，能外排包括抗菌藥物和消毒劑在內的多種有害物質。不少抗菌藥物耐藥基因由質粒攜帶，而質粒上可攜帶如qac等外排基因。抗菌藥物和消毒劑可能有共同作用的位點，靶位改變將帶來對抗菌藥物和消毒劑的敏感性降低。對抗菌藥物耐藥不一定會導致對消毒劑敏感性降低，多重耐藥菌是否會對消毒劑敏感性降低取決于菌種和耐藥機制。值得注意的是，共同的耐藥機制可能導致對抗菌藥物和消毒劑交叉耐藥。使用亞致死量的消毒劑可導致對抗菌藥物的MIC上升，實驗條件下，某種消毒劑(如三氯生)可誘導出對抗菌藥物敏感性降低的菌株。但在臨床中，關于消毒劑使用可誘導或篩查出抗菌藥物耐藥菌株的報道尚未見到。況且，實驗室條件下誘導的對消毒劑敏感性降低的菌株能夠被工作濃度的消毒劑殺滅，因而這些敏感性降低的菌株臨床意義很小。本研究顯示，耐藥菌對消毒劑的抵抗力變化不明顯，即使出現抵抗力，也只是最低抑菌濃度(MIC)提高2～3倍。

正如抗菌藥物濫用導致高耐藥率一樣，細菌耐消毒劑現象也逐漸突顯出來。因此，要重視消毒劑在臨床上的規范使用，醫療機構應該建立專門的消毒管理組織，加強科學使用消毒劑的管理和培訓。根據醫院實際情況，將醫療機構環境清潔衛生等級進行分類，并根據環境感染危險度類別和清潔衛生等級管理要求制定標準化操作規程，內容應包括清潔與消毒的工作流程、時間和頻率。應明確使用的清潔劑與消毒劑名稱、配制濃度、作用時間，以及使用中清潔劑與消毒劑更換的空間和時間規定等;明確醫務人員與環境清潔衛生服務人員的職責分工，指導臨床正確進行消毒，強調預防先于控制，提高手衛生依從性。積極開展臨床菌株對消毒劑敏感性監測及其相關研究，密切關注其變化趨勢，及時發現臨床菌株對消毒劑抗性的變化，以便有針對性地調整消毒劑在臨床實際工作中的有效使用濃度，甚至及時更換消毒劑種類，共同應對臨床菌株對消毒劑耐藥性的挑戰。

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