注射用硫酸鏈霉素致鱟試驗假陽性現象的研究

劉雪莉 袁坤 甄曉蘭

注射用硫酸鏈霉素是常用的氨基糖苷類抗生素，對其致熱物質的檢查，2000年版以前的《中國藥典》均為家兔法，2005年版《中國藥典》采用細菌內毒素檢查法，2010年版《中國藥典》沿用此法。在日常檢驗過程中，我們發現有幾批產品使用鱟試劑進行細菌內毒素檢查出現假陽性現象，對此我們做了如下分析。

1 材料

1.1 注射用硫酸鏈霉素，批號N090614，N090615，N090616，規格1 g/甁，深圳華藥南方制藥有限公司生產，編號依次為1#、2#、3#。

1.2 細菌內毒素國家標準品，批號150601-200968，150 EU/支，中國生物制品檢定所生產。

1.3 鱟試劑(TAL)，TAL1:批號:1005280，靈敏度:0.25EU/ml;TAL2:批 號:0911120，靈 敏 度:0.06 EU/ml;TAL3:批 號:0908242，靈 敏 度:0.25 EU/ml;TAL4:批 號:1003222，靈 敏 度:0.06 EU/ml。以上四種鱟試劑規格均為0.1 ml/支。TAL5:靈敏度:10～0.03 EU/ml，批號102052，規格2.2 ml/支。其中TAL1、TAL2為湛江博康海洋生物制品有限公司生產，其他為湛江安度斯生物制品有限公司生產。

1.4 抗增液(KS液)，批號:1002240，規格:10×0.6 ml/支，湛江安度斯生物有限公司生產。

1.5 儀器 細菌內毒素定量濁度分析儀，型號:LAL164-03，英國萊伯金耐特公司(Lab Kinetics Ltd)生產。微機熱原測定儀，型號:2010WRY，上海遼卓醫療器械有限公司生產。安捷倫1200高效液相色譜儀(蒸發光檢測器，型號:ELSD2000ES，Alltech公司生產)。

2 方法與結果

2.1 注射用硫酸鏈霉素凝膠限量法試驗進行細菌內毒素檢查 所有實驗操作均按中國藥典2010年版附錄［1］及2010年版《中國藥品檢驗標準操作規范》［2］要求操作，細菌內毒素檢查限值為2010年版《中國藥典》［1］要求“每1毫克鏈霉素中小于0.25 EU”，所用4批鱟試劑靈敏度復核結果均符合要求(λc在0.5～2 λ范圍內)，結果陽性對照均為陽性，陰性對照均為陰性(即證明試驗成立)的條件下，供試品管(SPL)與供試品陽性對照管(PPC)。結果表明:1#樣品用四種鱟試劑進行檢驗，均符合規定;2#、3#樣品用TAL1、TAL2進行檢驗，SPL管均為陽性，用TAL3、TAL4進行檢驗，兩支SPL管中出現一支陽性。為確證2#、3#樣品SPL管細菌內毒素含量是否超標，我們進一步采用家兔體內熱原物質檢查法進行試驗。見表1。

表1 注射用硫酸鏈霉素凝膠限量進行法細菌內毒素檢查結果

2.2 家兔體內熱原物質檢查法檢驗2#、3#樣品 家兔體內熱原物質檢查法高效模擬人體用藥后的致熱反應，其體溫變化能夠直觀反應藥品細菌內毒素水平(現代普遍認可，在嚴格GMP條件下生產的藥物，熱原物質等同于細菌內毒素)。按細菌內毒素公式理論限值L=K/M，已知L=0.25 EU/mg，K=5 EU·kg-1·h-1，則推算M(每千克體重每小時最大供試品劑量)為20 mg·kg-1·h-1，與2000年版《中國藥典》中熱原檢查標準相吻合。故我們采用每毫升中含20 mg硫酸鏈霉素為給藥濃度，0.5 ml/kg體重為給藥體積對家兔耳緣靜脈進行推注。結果表明:2#、3#樣品并未對家兔產生致熱反應，凝膠限量法SPL管所得陽性結果應為“假陽性”。見表2。

表2 家兔熱原法對2#、3#樣品的檢查結果

2.3 動態濁度法對2#、3#樣品中細菌內毒素定量測定 結果表明:2#、3#樣品內毒素實測值均遠小于檢驗限值0.25 EU/mg，進一步證明2#、3#樣品內毒素含量并未超標;加入KS液后內毒素實測值無變化(P＞0.05)，以及SPL管依然為陽性，表明致假陽性物質并非葡聚糖。見表3。

表3 動態濁度法對2#、3#樣品中細菌內毒素含量的測定結果n=3，±s

表3 動態濁度法對2#、3#樣品中細菌內毒素含量的測定結果n=3，±s

樣品編號 復溶劑 平均回收率(%)平均內毒素實測均值(EU/mg)凝膠限量法SPL 管結果2#BET水90.0±0.10.086±0.01++KS液90.2±0.20.082±0.00++3#BET水90.8±0.30.078±0.01++KS液90.4±0.30.080±0.00++

2.4 2#、3#、4#及5#樣品酸度及有關物質的檢查 考慮到樣品在流通過程中的環境不穩定因素可能導致產品質量變化，我們調取了廠家同批留樣樣品(編號為5#、6#)進行3.1試驗，結果SPL管均為陰性，即未出現假陽性現象。按照2010年版《中國藥典》方法要求［1］，我們對以上4種樣品同時進行了酸度及有關物質檢查項的對比檢驗，結果表明:抽驗樣品(2#、3#樣品)與同批廠家留樣(5#、6#樣品)相比酸度無變化，而有關物質顯著升高(P＜0.01)，這一結果提示2#、3#樣品的鱟試劑假陽性反應可能與有關物質含量增加有關。見表4。

表4 2#、3#、5#及6#樣品酸度及有關物質的檢查結果n=3

3 討論

目前凝膠限量試驗法為藥典規定的對藥品進行細菌內毒素限量檢查的主要方法之一，且有“當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法結果為準”的仲裁作用，假陽性實驗結果的出現對樣品很可能產生誤判。因此，對致假陽性物質的鑒別，為公正客觀判斷此品種的細菌內毒素檢查結果提供必要的實驗基礎。

鱟試劑在形成凝膠的反應機制中，還存在著一個使鱟試劑凝集的旁路，即一種抗腫瘤物質(1-3)-β-DGlucan(葡聚糖)，可激活鱟試劑中存在的G因子，活化的G因子同樣將試劑中的凝固酶原轉化為凝固酶，最后導致形成凝膠，致假陽性。日本學者Kakinuma報道這種物質使鱟試劑凝集的濃度范圍是10-6～10-3mg/ml，最佳濃度是10-5～10-4mg/ml［3］。已有文章報道葡聚糖的存在致鱟試劑產生假陽性現象［4，5］。致“假陽性”物質是否傳統多見的葡聚糖，我們采用動態濁度法進行細菌內毒素定量測定，同時選用葡聚糖抑制劑(KS液)，以期解決以上困惑，實驗結果表明本品中致假陽性物質并非葡聚糖。

樣品細菌內毒素檢查致“假陽性”的“真兇”到底為何種物質，查閱相關文獻，提示酸度和相關物質可影響細菌內毒素檢查［6，7］，故本研究進行了樣品的酸度及有關物質檢查試驗。結果提示鱟試劑假陽性反應與有關物質含量增加有關。

動態濁度法結果表明，2#、3#樣品所含內毒素的量為0.086 EU/mg與0.078 EU/mg，雖小于現行標準中的“0.25 EU/mg”，但與我們提高后的細菌內毒素檢驗標準［8］“0.10 EU/mg”已很接近，建議廠家在生產工藝上繼續提高以嚴格產品質量。

注射用硫酸鏈霉素的儲存條件是“陰涼處”(系指不超過20℃)，而我們從市場抽檢到的2#、3#樣品之所以有關物質顯著增加，可能與流通環節的環境不穩定因素有關，下一步我們將繼續通過加速試驗等對此進行探討研究。

總之，注射用硫酸鏈霉素鱟試劑反應的假陽性現象可能與樣品所有關物質含量增加有關，為提示生產廠家嚴格控制有關物質含量，從而減少鱟試驗假陽性現象以免誤判提出試驗依據。

1 國家藥典委員會主編.中華人民共和國藥典(二部).2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010.附錄99、999、附錄213.

2 中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所主編.中國藥品檢驗標準操作規范.北京:中國醫藥科技出版社，2010.310.

3 Kakinuma A，Asano T，Torii H，et al.Gelation of limulus.amoebocyte lysate by an amtiumor(1leads to3)-beta-D-glucan.Bioch and Bioph Res Comm，1981，101:434.

4 鐘勁松馮聚謹.葡萄糖氯化鈉注射液細菌內毒素檢查假陽性原因的探討.中國藥學雜志，2002，37:449-451.

5 葉良君，張強，張濤，等.β-葡聚糖對含糖大輸液細菌內毒素檢查的影響.中國藥業，2008，17:24-25.

6 陳瑜，韋群，馮聚錦，等.青霉素鈉中致使鱟試驗陽性的非內毒素物質的鑒別.中國抗生素雜志，2007，32:612-614.

7 何進，高軍.凝膠法細菌內毒素檢查的干擾因素及消除.中國藥師，2010，13:284-287.

8 劉雪莉，袁坤，張敏.注射用硫酸鏈霉素細菌內毒素檢查限值的研究.中國藥房，2012，23:65-67.