配方奶粉中克雷伯菌選擇性培養方法的研究

胡 萍，魏琳琳，王新華，余大為，許小紅，翟育忠，劉愛芳

（1.甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省慶陽市疾病預防控制中心，甘肅 慶陽745000）

配方奶粉中克雷伯菌選擇性培養方法的研究

胡 萍1，魏琳琳1，王新華1，余大為1，許小紅1，翟育忠1，劉愛芳2

（1.甘肅省疾病預防控制中心，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省慶陽市疾病預防控制中心，甘肅 慶陽745000）

目的 為提高配方奶粉中克雷伯菌的分離鑒定效率，研制專門用于克雷伯菌分離培養的選擇性培養基。方法 依據克雷伯菌生化特性，研制成改良麥康凱（MACI）培養基，觀察克雷伯菌及其他乳糖陽性的腸桿菌科細菌菌落在MACI平板、SS平板、麥康凱（MAC）平板和結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBGA）平板上的生長特點；用產酸克雷伯菌（ATCC13182）和肺炎克雷伯菌（ATCC10031）檢測MACI培養基的生長率和最低檢出限。結果 克雷伯菌在MACI平板上形成獨特的紅色菌落，而其他腸桿菌為無色菌落；肺炎克雷伯菌（ATCC10031）和產酸克雷伯菌（ATCC13182）在MACI培養基上的生長率分別為0.936 6和0.898 8；最低檢出限均為40 cfu/g。結論 MACI可作為分離克雷伯菌的理想選擇性培養基。

配方奶粉；克雷伯菌；選擇性培養方法

克雷伯菌屬腸桿菌科，營養要求不高。其中的肺炎克雷伯菌及產酸克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫源性感染菌，且對抗生素易產生耐藥性[1～5]。免疫力低下的個體感染此類菌后，可存在罹患肺炎、腸炎、腦膜炎、敗血癥和食物中毒等風險[2，6～14]。FAO/WHO于2004年5月在日內瓦召開的“嬰兒配方奶粉中阪崎桿菌和其他微生物”的聯席會議上，將克雷伯菌列為嬰兒配方奶粉中B類致病菌[15，16]，并要求成員國實施有效的監控。

克雷伯菌分解乳糖，在以往的腸道選擇性培養基上，不易與其他乳糖陽性的腸桿菌科的細菌區分。本項目組嘗試利用克雷伯菌可分解側金盞花醇的生化特點[17]，對傳統腸道菌選擇性培養基麥康凱（MAC）加以改良，研制出提高克雷伯菌分離培養效率的改良麥康凱（MACI）培養基，并對市場銷售配方奶粉中克雷伯菌進行分離鑒別，比較4種腸道選擇性培養基的分離效率，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 營養瓊脂（NA）、營養肉湯（NB）、緩沖蛋白胨水（BPW）、SS瓊脂、麥康凱（MAC）瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBGA）、3號膽鹽（北京奧博星生物技術有限責任公司）；中性紅（天津科密歐化學試劑有限公司）；生理鹽水（甘肅扶正藥業科技股份有限公司）；瓊脂粉、蛋白胨（日本進口分裝）；側金盞花醇（國藥集團化學試劑有限公司）；VITEK 2 GN-菌種鑒定卡（美國bioMerieux.Ine公司）。以上試劑均在有效期內。

1.1.2 儀器 VITEK 2全自動生化鑒定儀（bioMerieux）、恒溫培養箱、麥氏濁度比濁儀（法國梅里埃公司）。

1.1.3 試驗菌株 產酸克雷伯菌（ATCC13182）、肺炎克雷伯菌（ATCC10031）、產氣腸桿菌（NCIMB10102）、陰溝腸桿菌（ATCC23355）、費勞地枸櫞酸桿菌（ATCC8090）標準菌株（上海漢尼生物技術有限公司）；大腸埃希菌（ATCC25922）標準菌株、產酸克雷伯菌（8株）和肺炎克雷伯菌（12株）臨床分離菌株由甘肅省人民醫院檢驗中心饋贈。

1.2 MACI培養基的研制

1.2.1 參照MAC培養基的制備方法[18]將其中的乳糖成分用側金盞花醇替代，配制方法如下：蛋白胨20 g，氯化鈉5 g，瓊脂20～25 g，膽鹽5 g，蒸餾水1 000 ml，將各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調節pH至7.4，加入1%中性紅水溶液5 ml，分裝適當容器，115℃高壓滅菌15 min，溫度降至60℃左右，加入側金盞花醇10 g，充分混勻，制成平板備用。

1.2.2 選擇性培養基的分離培養 實驗室引進的菌株均經VITEK 2進行鑒定。菌株復活后，分別接種腸道菌選擇性培養基SS、MAC、VRBGA和MACI平板，培養后觀察菌株在各種平板上的菌落形態。

1.2.3 MACI培養基的質控[19]（1）克雷伯菌在MACI培養基上生長率的測定。產酸克雷伯菌（ATCC13182）和肺炎克雷伯菌（ATCC10031）經NB培養后，菌液濃度達到108個/ml。用生理鹽水對菌液依次做10倍遞增稀釋，稀釋濃度至100個/ml。各取1 ml菌液，涂布法分別接種于NA平板和MACI平板，檢測克雷伯菌在MACI培養基上的生長率（生長率=待測培養基菌落計數/對照培養基菌落計數），結果見表1。

表1 克雷伯菌在不同濃度培養基上的生長試驗

（2）克雷伯菌在MACI培養基上最低檢出限的測定。無菌取8份配方奶粉（已知無腸桿科細菌），每份25 g，分別加到225 ml NB中，均質。取濃度為100～107個/ml的菌液各1 ml，分別加到8份配方奶粉中，混勻，然后各取1 ml，涂布法接種于MACI平板，結果見表2。

表2 不同濃度克雷伯菌在MACI瓊脂上的生長計數情況

1.3 市場銷售配方奶粉中克雷伯菌的檢測及MACI培養基應用效果的評判

1.3.1 樣品 市場銷售的1階段（0～6月）、2階段（6～12月）、3階段（1～3歲）和4階段（3歲以上）18個品牌的配方奶粉，共計98份。

1.3.2 配方奶粉中克雷伯菌的檢測步驟 無菌稱取配方奶粉100 g置于900 ml BPW中混勻培養后，從中取25 ml置于225 ml NB中混勻培養，分別轉種MACI、SS、MAC和VRBGA平板培養。挑取可疑菌落，涂片革蘭氏染色，應用VITEK 2全自動生化鑒定儀的GN-菌種鑒定卡對革蘭氏陰性桿菌進行鑒定。檢測過程中，均帶標準菌株作參考。

1.3.3 MACI培養基的應用效果評判 基本程序同1.3.2。分別將MAC、SS、VRBGA、MACI分離到的可疑菌落數與生化鑒定確認的菌落數進行比較，計算出各培養基的分離陽性率（分離陽性率=生化鑒定確認的菌落數／可疑菌落數），并借此對MACI的分離特異性做出評判。

2 結果與分析

（1）實驗室引進菌株經VITEK 2鑒定，結果均符合試驗要求。

（2）通過對試驗菌株菌落的觀察發現，在VRBGA、SS和MAC培養基上，菌落均呈濕潤、光滑、邊緣整齊、紅色的形態特點，因此，克雷伯菌不易與其他腸桿菌進行判讀和鑒別。MACI平板上，試驗菌株進行中的克雷伯菌菌株均形成紅色、直徑約2 mm、突起、黏稠、相鄰融合的菌落，其他腸桿菌的菌落為無色，雖然產氣腸桿菌的菌落也為紅色，但相鄰菌落不發生融合現象。

（3）克雷伯菌在MACI上的生長率。NA是需氧和兼性厭氧菌生長的良好培養基。在此培養基上，肺炎克雷伯菌（ATCC 10031）和產酸克雷伯菌（ATCC13182）不同濃度的菌液均生長良好、計數變化明顯。由表1可見，當菌液稀釋濃度達到102cfu/ ml時，該菌即可在NA培養基上生長，在MACI培養基上也能達到很好的生長效果。依據食品微生物學檢驗菌落計數測定的報告原則[20]，選擇菌落數在30～300的稀釋度結果，以NA培養基為對照，計算出MACI培養基的生長率分別為0.936 6和0.898 8。

（4）最低檢出限。1 ml菌液加入250 ml含有25 g配方奶粉的NB中，菌濃度被稀釋了250倍。表2顯示，兩種菌在104cfu/ ml稀釋度時，均可生長，故MACI平板上的最大稀釋生長濃度為104cfu/250 ml，兩種克雷伯菌的最低檢出限均為40 cfu/g。

（5）市場銷售配方奶粉中克雷伯菌的檢測。表3顯示，在4種不同選擇性培養基分離克雷伯菌的試驗中，MACI的分離陽性率最高，為75.0%，VRBGA和MAC相同，分別為50.0%，SS為37.5%。

表3 不同選擇性培養基分離克雷伯菌效果比較

3 討論

在腸桿菌科細菌常用的分離培養基MAC、SS、VRBGA上，克雷伯菌與發酵乳糖陽性的細菌菌落均呈紅色，不易區分。本項目組依據克雷伯菌可分解側金盞花醇的特點[17]，研制了MACI，經測試，克雷伯菌在MACI上可形成特點顯著、易與其他腸桿菌區分的菌落，依據《培養基性能測試實用指南》的要求，經對MACI培養基進行的生長率與最低檢出限試驗結果表明，肺炎克雷伯菌（ATCC10031）和產酸克雷伯菌（ATCC13182）在該培養基上的生長率及最低檢出限均符合預期效果。

對市場銷售的98份嬰幼兒配方奶粉的檢測結果表明，MACI對克雷伯菌的分離陽性率高于其他3種培養基，經對4種選擇性培養基組份對比分析，SS瓊脂的抑菌劑成分最多，達4種，且含量高[19]，而VRBGA瓊脂為2種[21]，MAC和MACI瓊脂僅為1種，且含量都較低[19]，是否可以認為，培養基中抑菌劑成分的多寡、含量的高低和可疑菌落挑選是造成克雷伯菌分離效率差異的原因。我們認為MACI培養基為克雷伯菌分離培養的理想培養基。

[1]賢永嫦.肺炎克雷伯菌耐藥性分析[J].醫學檢驗，2011，18（3）：67.

[2]李景云，馬越，姚蕾.內科、外科、兒科、重癥監護病房和門診患者分離的肺炎克雷伯菌耐藥性分析[J].中國抗生素雜志，2003，28（9）：537-540.

[3]邱清芳.大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌AmpC酶的檢測[J].醫學檢驗與臨床，2007，18（6）：24-26.

[4]華杰，李艷霞.肺炎克雷伯菌醫院感染及耐藥性監測[J].中華醫院感染學雜志，2006，16（10）：1172-1173.

[5]尹建雯，徐聞，古文鵬.云南省發現1株攜帶NDM-1基因的產酸克雷伯菌[J].疾病監測，2012，27（3）:211-217.

[6]董捷，于蘭，趙郁，等.產酸克雷伯菌引起的食物中毒臨床分析[J].中華傳染病雜志，2002，21（1）：69.

[7]黃鋒，嚴靖，曹金德.兒科病房流行肺炎克雷伯氏菌腸炎一起[J].南通醫學院學報，1997，17（2）：295-296.

[8]劉如安，劉艷賓.肺炎克雷伯菌下呼吸道感染74例及耐藥性分析[J].醫學臨床研究，2006，23（7）：1104-1105.

[9]吳惠.克雷伯菌致嬰幼兒腹瀉流行病學分析[J].河南醫學研究，2004，13（2）：178-180.

[10]劉志業，吳景才.嬰兒腹瀉克雷伯菌的分離鑒定及其臨床意義[J].醫學綜述，1996，2（10）：572-573.

[11]孫紅，王世平，黃明越.食物中毒樣品中檢出產酸克雷伯菌的報告[J].中國公共衛生，2001，17（12）：1132.

[12]凌勤芳.一起由肺炎克雷伯菌引起的食物中毒[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18（6）：1203-1226.

[13]賈艷，孫長江，韓文瑜.肺炎克雷伯菌研究進展[J].微生物學雜志，2006，26（5）：67.

[14]丁娟，劉尚才，常世卿.克雷伯氏菌骨傷科感染及藥敏分析[J].中醫正骨，2003，15（12）：37-38.

[15]Joint FAO/WHO Workshop.Enterobacter sakazakii and microorganisms in powdered infant formula[M].Geneva：WHO，2004.

[16]Joint FAO/WHO Workshop.Enterobacter sakazakii and Salmonella in powdered infant formula[M].Rome，Italy：FAO，2006.

[17]張卓然.臨床微生物學和微生物檢驗[M].北京：人民衛生出版社，1988.

[18]中等衛生學校試用教材《微生物學及檢驗技術》編寫組.微生物學及檢驗技術[M].廣州：廣東人民出版社，1979.

[19]國家認證認可監督管理委員會.SN/T1538.2-2007培養基制備指南第2部分：培養基性能測試實用指南[S].北京：中國標準出版社，2007.

[20]中華人民共和國衛生部.GB4789.2-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[21]中華人民共和國國家標準.SN/T0738-1997出口食品中腸桿菌科檢驗方法[S].北京：中國標準出版社，1997.

G424.31

B

1671-1246（2014）07-0114-03

注：本文系2010年甘肅省衛生行業計劃項目（GSWST-2010-25）