市售鹿鞭的DNA指紋鑒定研究

劉洋　張麗華

[摘要] 目的 探討鹿鞭及牛鞭線粒體細胞色素b基因（Cytb）部分序列片段特征，建立中藥材鹿鞭敏感、特異的DNA分子標記學鑒定方法。方法 對市售鹿鞭進行樣本處理，模板制備，采用鹿鞭特異性引物進行PCR反應，對市售鹿鞭樣本采取DNA指紋鑒定。結果 對市售鹿鞭中藥材進行mtDNA鑒定，有三個樣本為正品。結論 此方法對市售鹿鞭鑒定，可準確辨別正品與偽品。重現性、穩定性好，簡便準確而可行，說明鹿鞭mtDNA具有特異性指紋特征，所得鹿鞭DNA指紋特征圖譜可用于市售鹿鞭的鑒定。

[關鍵詞] 市售鹿鞭；線粒體DNA；DNA指紋鑒定

[中圖分類號] R282.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）02-50-03

20世紀80年代，由于分子分類學的出現，使人們從研究生物形態表征進入到生物的DNA遺傳物質。人們可以根據DNA系列的差異來鑒定生物物種，是因為同種生物體有相同的DNA系列，不同種生物有不同DNA系列。除了礦物類藥材外大多數藥材是從動植物中得到，動植物藥材一般從死亡的干燥生物或者其組織器官中來。隨著生物體的逐漸死亡，DNA會被核酸酶大量降解，使藥材中DNA的分析有一定難度。近些年，分子生物學發展速度很快，尤其是微量DNA提取技術與PCR擴增技術，使從藥材中提取分析微量的DNA成為可能，也為藥材進行DNA技術鑒定提供了可能。DNA分析技術使中藥材和與其容易混淆品種之間如何更好地鑒定找到了一個好辦法。mtDNA是遺傳信息的載體，它被認為是動物起源進化的研究和分析群體遺傳的最佳對象，Cytb進化速度適中，是分析種內、種間遺傳多樣性和進化關系的適當的DNA片段，可以應用于生物的分類、系統發育和遺傳多樣性的研究 。本研究旨在探索將DNA指紋鑒定技術應用于市售鹿鞭鑒定中，以此提高其鑒定準確性[1]。

1 材料與儀器

1.1 一般材料

1.1.1 樣本 市售的鹿鞭由吉林市參茸市場隨機購買，共2批，抽取6個樣本，編號為：1、2、3、4、5、6。干品牛鞭樣本，編號為7。鹿鞭及其偽充藥材均經吉林市食品藥品檢驗所鑒定。

1.1.2 酶及DNA分子量標準 Taq酶：購自北京鼎國公司，λDNA/HindⅢ：購自TIANGEN公司，DNA MarkerⅠ：購自TIANGEN公司。

1.1.3 主要化學試劑 瓊脂糖：購England，dNTP及PCR緩沖液：購自北京置鼎國公司，其他常用化學試劑：國產或進口分析純。

1.2 主要儀器設備

TGL-16G臺式高速離心機：上海醫用分析儀器廠，H-2050R型臺式低溫高速離心機：美國Becman公司。

2 方法

2.1 樣本的前處理

將市售鹿鞭中藥材6個樣本及干品牛鞭的龜頭及陰莖部分，用粉碎機粉碎處理，將粉碎后的干燥纖維置于4℃保存，備用。

2.2 模板的制備

取粉碎后的市售鹿鞭6個樣本及干品牛鞭1個樣本各1.0g，徹底清洗后紫外照射30min，分別轉入25mL離心管中，加入10倍左右的0.5mol/L EDTA（pH 8.0），56℃保溫72h。4000rpm 4℃離心15min，倒掉上清液。加入裂解液5mL，56℃水浴中保溫過夜，至組織完全消化溶解。消化液用等體積飽和酚抽提1次，等體積酚-氯仿抽提2次，氯仿-異戊醇（24∶1）抽提1次。加入2倍體積的-20℃的無水乙醇，混勻放于冰箱中過夜。15000rpm 4℃離心30min，真空干燥，溶解于TE緩沖液。

2.3 聚合酶鏈式反應

以提取的市售鹿鞭和干品牛鞭mtDNA為模板，滅菌雙蒸水作為陰性對照進行PCR。反應體系30μL，在0.5mL PCR反應管中依次加入10×PCR buffer 5μL，1.25mmol/L dNTP 4μL，10pmol/L引物1和引物2各2.0μL，Taq DNA聚合酶（1U）1μL，模板2μL，雙蒸水補至30μL（總反應體系為30?L）。反應程序：94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，28個循環后于72℃延伸5min[2]。

2.4 電泳鑒定

將PCR產物各取6?L，加2?L 6×loading Buffer，混勻后點樣于2%瓊脂糖凝膠中，DNA MarkerⅠ為參照，60V，30min，成像并拍照。

3 結果

4 討論

線粒體DNA基因組的優點很多，比如分子結構簡單、嚴格的母系遺傳、無重組、與核DNA基因組無共同序列、多拷貝、進化速率快、分子鐘理論等，和核DNA相比更容易檢測，親緣關系相關或相近的物種都能得到區分和鑒定。采用mtDNA作為分子標記的研究工作已被廣泛地展開，而且比同等長度的核DNA基因研究更為深入。現在常用的分子標記物有Cytb基因、16SrRNA基因、12S rRNA基因、Co基因、D-loop 控制區、NP基因等，其間Cytb基因由于其獨具的優勢而廣泛研究應用。Cytb起源很古老，發現于許多原核生物的細胞和幾乎所有的真核生物中。它不僅在屬間、種間存在多樣性，而且在品種內、品種間個體間都存在多樣性。所以對闡明生物間的親緣關系和物種鑒定方面都具有極其重要的意義[3]。Cytb基因和其余線粒體基因比較，進化速度適中，容易被一些通用引物擴增和測序，從結構和功能方面看也是當前研究最為清楚的基因之一，常用作科以上分類單位和種間的進化研究。Cytb基因是線粒體功能區，在物種進化研究中，線粒體功能區的序列測定作為重要依據得到廣泛應用。在進化過程中，基因序列變異率相對較高，種間差異較大，是當今脊椎動物中被測序得最廣泛的基因。Cytb基因是研究種間進化關系最好的基因，越來越廣泛地應用，有可能成為分類學的標準片段，在物種鑒定中可將Cytb基因檢測作為一種重要的手段。

在實驗操作中，我們應從反應的模板DNA濃度、反應體系中dNTP濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量以及引物的選擇這幾方面進行反復摸索，找到反應的最佳條件，使反應后的擴增產物具有高度重復性。在進行鑒定前，應將藥材進行徹底清洗后紫外照射30min，避免結果失真。

鑒定市售鹿鞭所用的特異性引物，是選擇了正品鹿鞭和牛鞭有顯著差異的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均來自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鮮品鹿鞭與牛鞭鑒定中曾使用，新鮮品鹿鞭擴增出306bp基因片段，而牛鞭未擴增出相同的基因片段[4-6]。本實驗采用此鹿鞭特異性引物對市售鹿鞭進行的DNA指紋鑒定，與新鮮品鹿鞭和牛鞭鑒定結果一致，和吉林省吉林市食品藥品檢驗所的鑒定結果相符。該結果表明：本課題組設計的特異性鑒別引物，可以用于市售鹿鞭與偽品的鑒別。從研究的結果來看，將分子生物學技術引入到動物類藥材的鑒定中是可行的，說明用以上技術鑒定動物類藥材的有效性和可靠性[7-8]。

[參考文獻]

[1] 張麗華，李明成，王冰梅，等.貂心線粒體mtDNA鑒定及特征分析[J].中國藥學雜志，2008，43（22）：1694-1696.

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[4] 張麗華，李明成，王冰梅.貂組織線粒體DNA及細胞色素b鑒定及特征[J].吉林大學學報（醫學版），2008，34（5）：790-793.

[5] Zhang Li-hua，Yang Ming-yan，Wang Bing-mei，et al.Application of molecular biology Techniques on the Identification of Martes zibellina L.Hearts and its Counterfeits[C].CNPTM，2009：448-451.

[6] 劉洋，楊明妍，張麗華，等.梅花鹿鞭與偽品牛鞭細胞色素bDNA指紋鑒定[J].時珍國醫國藥，2010，184（21）：3274-3275.

[7] Crimi M ，Rigolio R.The mitochondrial genome ，a growing interest inside an organelle[J].Int J Nanomedicine，2008，3（1）：51-57.

[8] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國醫藥科學，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）

在實驗操作中，我們應從反應的模板DNA濃度、反應體系中dNTP濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量以及引物的選擇這幾方面進行反復摸索，找到反應的最佳條件，使反應后的擴增產物具有高度重復性。在進行鑒定前，應將藥材進行徹底清洗后紫外照射30min，避免結果失真。

鑒定市售鹿鞭所用的特異性引物，是選擇了正品鹿鞭和牛鞭有顯著差異的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均來自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鮮品鹿鞭與牛鞭鑒定中曾使用，新鮮品鹿鞭擴增出306bp基因片段，而牛鞭未擴增出相同的基因片段[4-6]。本實驗采用此鹿鞭特異性引物對市售鹿鞭進行的DNA指紋鑒定，與新鮮品鹿鞭和牛鞭鑒定結果一致，和吉林省吉林市食品藥品檢驗所的鑒定結果相符。該結果表明：本課題組設計的特異性鑒別引物，可以用于市售鹿鞭與偽品的鑒別。從研究的結果來看，將分子生物學技術引入到動物類藥材的鑒定中是可行的，說明用以上技術鑒定動物類藥材的有效性和可靠性[7-8]。

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[8] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國醫藥科學，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）

在實驗操作中，我們應從反應的模板DNA濃度、反應體系中dNTP濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量以及引物的選擇這幾方面進行反復摸索，找到反應的最佳條件，使反應后的擴增產物具有高度重復性。在進行鑒定前，應將藥材進行徹底清洗后紫外照射30min，避免結果失真。

鑒定市售鹿鞭所用的特異性引物，是選擇了正品鹿鞭和牛鞭有顯著差異的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均來自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鮮品鹿鞭與牛鞭鑒定中曾使用，新鮮品鹿鞭擴增出306bp基因片段，而牛鞭未擴增出相同的基因片段[4-6]。本實驗采用此鹿鞭特異性引物對市售鹿鞭進行的DNA指紋鑒定，與新鮮品鹿鞭和牛鞭鑒定結果一致，和吉林省吉林市食品藥品檢驗所的鑒定結果相符。該結果表明：本課題組設計的特異性鑒別引物，可以用于市售鹿鞭與偽品的鑒別。從研究的結果來看，將分子生物學技術引入到動物類藥材的鑒定中是可行的，說明用以上技術鑒定動物類藥材的有效性和可靠性[7-8]。

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[8] 劉洋，張麗華，薄艷，等.鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定[J].中國醫藥科學，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）