高效液相色譜法測定尼可地爾中的有關物質

李步良　黃東　王昉

[摘要] 目的 建立尼可地爾中有關物質的測定方法。方法 碳十八烷鍵合硅膠（5μm）填充4mm×25cm不銹鋼柱；流動相為水：四氫呋喃：三乙胺：三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；檢測波長：254nm；流速：調整流速使尼可地爾出峰時間約為18min。結果 尼可地爾與主要雜質能得到有效分離，各雜質在0.2～4.0μg/mL范圍內呈良好線性關系。結論 本測定方法靈敏度高，準確可靠，可以控制尼可地爾中有關物質的含量。

[關鍵詞] 尼可地爾；有關物質；系統適用性

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）02-52-03

尼可地爾（nicorandil），又名硝煙酯，化學名為N-（α-羥乙基）煙酰胺硝酸酯，是日本在1976年研制的煙酸類衍生物。它是一種鉀通道激活劑，可以舒張動脈血管，同時又具有硝酸酯基結構，可以舒張靜脈血管。目前，尼可地爾作為一種新型藥物，在臨床上廣泛用于心絞痛、高血壓等疾病的治療中，增加冠脈血流量，不影響血壓，心率及傳導，用于治療心絞痛，與硝酸酯一樣，煙浪丁可激活細胞質鳥苷酸環化酶，從而導致細胞內環磷酸鳥苷升高和細胞內鈣的降低，同時引起血管平滑肌松弛。

按照ICH指南Q2A、Q2B規定，要求為尼可地爾成品在出口放行及穩定性試驗中有關物質的準確測定，提供合適的方法，目前普遍采用TLC方法來控制有關物質，但該方法適用性差，準確度不高，不能準確定量。參考文獻[1-7]方法，本文采用高效液相色譜HPLC法建立了尼可地爾中有關物質的分析方法，并對該方法進行了驗證，其回收率、線性、專屬性、精密度、檢測限和定量限等均滿足要求，方法可行[1]。

1 儀器設備與試劑試藥

HPLC高效液相色譜儀系統：沃特斯高效液相色譜儀2489檢測器，2695分離單元（四元泵、717自動進樣器、柱溫箱）；軟件：Empower3.工作站；HP1008打印機。

尼可地爾工作標準品（20100701）；四氫呋喃（色譜純200808066，美國天地公司）；三乙胺（色譜純08071，美國默克公司） 三氟乙酸（色譜純09012，美國默克公司）尼可地爾酰化物工作對照品（lot：20100601，含量：99.0%中間體）；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯（lot：20100602，含量：99.2%）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（5μm）25mm×4mm。流速為1.0mL/min；檢測波長為254nm。流動相：水：四氫呋喃：三乙胺：三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取20mg尼可地爾用流動相溶解并稀釋至10.0mL容量瓶中作為樣品溶液。取10μL樣品溶液注入液相色譜儀。

系統適應性：靈敏度測試準確量取1mL供試品溶液，加入流動相制成50mL作為系統適應性溶液。吸取1mL系統適應性溶液，加入流動相準確制成20mL作為儀器靈敏度測試液，各取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，在靈敏度測試圖譜中，尼可地爾峰面積約為系統適應性測試圖譜中尼可地爾峰面積的2%～8%。

2.3 系統適應性試驗

溶劑測試：取稀釋溶劑10μL進樣，作為溶劑空白，考察溶劑對雜質測定有無干擾，樣品測定中溶劑空白產生的峰應忽略。

系統測試：取10mg N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯用流動相制成10mL，吸取1mL加入10mL樣品溶液，按上述條件進行測試，N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯與尼可地爾分離度應不小于3.0。

系統重復性試驗：取10μL系統適應性溶液，按上述條件測試連續進樣6次。記錄色譜圖，按峰面積計算，尼可地爾峰面積相對平均偏差不超過1.5%。

2.4 方法的專屬性測試

雜質及尼可地爾的分子結構確認（委托南京師范大學分析中心檢測）：通過紫外分光光度計、液相色譜-質譜、紅外分光光度計等方法進行結構解析確證各雜質的分子結構[2]。

已知單一雜質的定性：分別取尼可地爾酰化物（lot：20100601，含量：99.0%中間體） 10mg，至25mL的容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。進樣，記錄尼可地爾酰化物的保留時間，用保留時間對尼可地爾酰化物進行定性，N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯（lot：20100602，含量：99.2%）15mg，至25mL的容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。進樣，記錄N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯的保留時間，用保留時間對N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯進行定性，各雜質的分離度和理論板數都符合規定，見圖1。

2.5 強制降解實驗

分別精密稱取尼可地爾樣品細粉20mg分別置于20mL容量瓶中，共5份，分別在強酸1、2、3、5h，強堿1、2、3、5h，強氧化1、2、3、5h，高溫、光照1、3、5、10d等條件進行強制降解實驗，用溶劑稀釋至刻度，即得1.0mg/mL的溶液，以上樣品分別用液相色譜儀進樣測定，由色譜圖可看出各破壞條件下的降解產物與尼可地爾主成分峰均有良好的分離[3]。

2.6 進樣重復性和精密度

取標準溶液連續重復6次進樣，按峰面積計算，在重復性和中間精密度測試項下，各組分峰面積的相對偏差均小于2.0%；重復性和中間精密度兩者之間沒有顯著性差異。中間精密度和重復性均符合規定。

2.7 尼可地爾及雜質的線性回歸試驗

標準貯備液：分別精密稱取以下標準品：尼可地爾酰化物工作對照品（lot：20100601，含量：99.0%中間體）；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯（lot：20100602，含量：99.2%）和尼可地爾10mg，各至一個50mL容量瓶中，分別加入溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，混合均勻。在分別取5～50mL得每個已知組分的濃度均約為20μg/mL。

精密量取有關物質對照品的貯備液0.5、1、2.5、4、5、6、10mL分別至8個50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，制成濃度分別為0.2、0.4、1.0、1.6、2.0、2.4、4.0μg/mL的一系列溶液，搖勻，各精密量取10μL，注入液相色譜儀。記錄各濃度的色譜峰面積，以峰面積A對濃度C （μg/mL） 進行線性回歸，得尼可地爾的有關物質的回歸方程分別為：A=42196.3C-128.1， r=0.9995；A=38042.01C+1026.01， r=0.9990。結果表明有關物質Ⅰ及有關物質Ⅱ在0.2～4.0μg/mL的范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已測定有關物質含量的樣品適量，共3份，分別置100mL棕色容量瓶中，加適量溶劑溶解，然后各精密加入有關物質對照品的貯備液1.6、2.0和2.4mL，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“樣品有關物質測定”項下的方法分別測定有關物質的含量，減去樣品本底，計算回收率，結果測得的平均回收率分別為：尼可地爾酰化物為99.5%，RSD=0.93%（n=9）；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯為98.6%， RSD=1.1%（n=9）。

2.9 尼可地爾雜質檢測限、定量限的測定

在選定的色譜條件下，按信噪比為3對最低檢測限進行測定，結果表明：尼可地爾酰化物的濃度為5.20×103μg/mL，進樣量為10μL時，最低檢測限量為0.2ng。N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯的濃度為1.53×103μg/mL，進樣量為10μL時，最低檢測限量為0.5ng。按信噪比為10對最低定量限進行測定，結果表明尼可地爾酰化物的濃度為1.52×102μg/mL，進樣量為10μL時，最低定量限量為0.5ng。N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯的濃度為4.55×102μg/mL，進樣量為10μL時，最低定量限量為0.9ng。其他未知雜質的檢測限和定量限以尼可地爾來進行評價，依次為0.05ng和0.01ng。

2.10 尼可地爾樣品溶液的穩定性測試

取尼可地爾1.0mg/mL樣品溶液存放在冷處分別于0、4、8、12、24和48h進樣測定。記錄有關物質的峰面積，并用歸一化法考察有關物質的含量，結果有關物質含量與初始溶液相比無明顯變化，RSD為1.0%，而且沒有降解產物出現，結果表明，在冷處條件下，樣品溶液在48h內可保持穩定[6]。

2.11 尼可地爾樣品中有關物質測定（表1）

取樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至主成分保留時間的2.5倍。按面積歸一化法計算單一雜質及總雜質的含量，尼可地爾樣品雜質含量測定結果符合歐洲藥典European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia[S]，7.0.ed 規定[7]。

3 討論

試用日常檢驗常用的色譜柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱Purospher C18柱進行測定均可獲得滿意的結果， 說明本法對色譜柱沒有一定的選擇性。

取尼可地爾工作標準品、尼可地爾酰化物工作對照品；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯用溶劑溶解稀釋制成溶液，在200～400nm波長掃描，尼可地爾在254nm處有最大吸收，尼可地爾酰化物在262nm處有最大吸收；N-（2-羥基乙基）異煙堿在273nm處有最大吸收，在254nm處兩個雜質均有較大吸收，所以選擇254nm作為本品有關物質的檢測波長[8]。

實驗結果表明，采用HPLC高效液相色譜法來檢查尼可地爾中的有關物質，尼可地爾中的主成分、各中間體和分解產物均能達到較好的分離，該方法簡便實用方法可以滿足尼可地爾藥物的雜質控制和穩定性研究有一定的參考意義[9]。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部） [S].北京：化學工業出版社，2005.

[2] 閻平，謝劍煒.高效液相色譜法測定鹽酸噻吩諾啡有關物質的方法研究[J].分析試驗室，2006，25（12）：8-10.

[3] 王建，洪利婭，倪坤儀.液相色譜-蒸發光散射-電噴霧離子阱質譜法測定硫酸異帕米星及其有關物質[J].分析化學， 2006，34（9）：19-22.

[4] 黃東.高效液相色譜法測定氟他胺中有關物質[J].藥學與臨床研究，2007，15（6）：452-455.

[5] 黃春森，黃東，李步良.高效液相色譜法測定苯扎貝特中的有關物質[J].中國醫療前沿，2008，3（16）：99-100.

[6] 李寧，劉宇，宮平，等.CD-01鹽酸鹽中有關物質的HPLC法檢測及穩定性考察[J].沈陽藥科大學學報，2005，22（6）：429-432.

[7] European Pharmacopoeia Commission.European pharmacopoeia[S].5 ed.EDQM，2005.

[8] 李明華，阮朝濱，陳雨，等.HPLC法測定鹽酸氨溴索片的有關物質[J].醫藥前沿，2012，34（31）：151-153.

[9] 王守箐.HPLC測定枸櫞酸莫沙必利片的有關物質[J].藥物分析雜志，2011，31（12）：2330-2332.

（收稿日期：2013-11-07）

精密量取有關物質對照品的貯備液0.5、1、2.5、4、5、6、10mL分別至8個50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，制成濃度分別為0.2、0.4、1.0、1.6、2.0、2.4、4.0μg/mL的一系列溶液，搖勻，各精密量取10μL，注入液相色譜儀。記錄各濃度的色譜峰面積，以峰面積A對濃度C （μg/mL） 進行線性回歸，得尼可地爾的有關物質的回歸方程分別為：A=42196.3C-128.1， r=0.9995；A=38042.01C+1026.01， r=0.9990。結果表明有關物質Ⅰ及有關物質Ⅱ在0.2～4.0μg/mL的范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已測定有關物質含量的樣品適量，共3份，分別置100mL棕色容量瓶中，加適量溶劑溶解，然后各精密加入有關物質對照品的貯備液1.6、2.0和2.4mL，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“樣品有關物質測定”項下的方法分別測定有關物質的含量，減去樣品本底，計算回收率，結果測得的平均回收率分別為：尼可地爾酰化物為99.5%，RSD=0.93%（n=9）；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯為98.6%， RSD=1.1%（n=9）。

2.9 尼可地爾雜質檢測限、定量限的測定

在選定的色譜條件下，按信噪比為3對最低檢測限進行測定，結果表明：尼可地爾酰化物的濃度為5.20×103μg/mL，進樣量為10μL時，最低檢測限量為0.2ng。N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯的濃度為1.53×103μg/mL，進樣量為10μL時，最低檢測限量為0.5ng。按信噪比為10對最低定量限進行測定，結果表明尼可地爾酰化物的濃度為1.52×102μg/mL，進樣量為10μL時，最低定量限量為0.5ng。N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯的濃度為4.55×102μg/mL，進樣量為10μL時，最低定量限量為0.9ng。其他未知雜質的檢測限和定量限以尼可地爾來進行評價，依次為0.05ng和0.01ng。

2.10 尼可地爾樣品溶液的穩定性測試

取尼可地爾1.0mg/mL樣品溶液存放在冷處分別于0、4、8、12、24和48h進樣測定。記錄有關物質的峰面積，并用歸一化法考察有關物質的含量，結果有關物質含量與初始溶液相比無明顯變化，RSD為1.0%，而且沒有降解產物出現，結果表明，在冷處條件下，樣品溶液在48h內可保持穩定[6]。

2.11 尼可地爾樣品中有關物質測定（表1）

取樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至主成分保留時間的2.5倍。按面積歸一化法計算單一雜質及總雜質的含量，尼可地爾樣品雜質含量測定結果符合歐洲藥典European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia[S]，7.0.ed 規定[7]。

3 討論

試用日常檢驗常用的色譜柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱Purospher C18柱進行測定均可獲得滿意的結果， 說明本法對色譜柱沒有一定的選擇性。

取尼可地爾工作標準品、尼可地爾酰化物工作對照品；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯用溶劑溶解稀釋制成溶液，在200～400nm波長掃描，尼可地爾在254nm處有最大吸收，尼可地爾酰化物在262nm處有最大吸收；N-（2-羥基乙基）異煙堿在273nm處有最大吸收，在254nm處兩個雜質均有較大吸收，所以選擇254nm作為本品有關物質的檢測波長[8]。

實驗結果表明，采用HPLC高效液相色譜法來檢查尼可地爾中的有關物質，尼可地爾中的主成分、各中間體和分解產物均能達到較好的分離，該方法簡便實用方法可以滿足尼可地爾藥物的雜質控制和穩定性研究有一定的參考意義[9]。

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[9] 王守箐.HPLC測定枸櫞酸莫沙必利片的有關物質[J].藥物分析雜志，2011，31（12）：2330-2332.

（收稿日期：2013-11-07）

精密量取有關物質對照品的貯備液0.5、1、2.5、4、5、6、10mL分別至8個50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，制成濃度分別為0.2、0.4、1.0、1.6、2.0、2.4、4.0μg/mL的一系列溶液，搖勻，各精密量取10μL，注入液相色譜儀。記錄各濃度的色譜峰面積，以峰面積A對濃度C （μg/mL） 進行線性回歸，得尼可地爾的有關物質的回歸方程分別為：A=42196.3C-128.1， r=0.9995；A=38042.01C+1026.01， r=0.9990。結果表明有關物質Ⅰ及有關物質Ⅱ在0.2～4.0μg/mL的范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已測定有關物質含量的樣品適量，共3份，分別置100mL棕色容量瓶中，加適量溶劑溶解，然后各精密加入有關物質對照品的貯備液1.6、2.0和2.4mL，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“樣品有關物質測定”項下的方法分別測定有關物質的含量，減去樣品本底，計算回收率，結果測得的平均回收率分別為：尼可地爾酰化物為99.5%，RSD=0.93%（n=9）；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯為98.6%， RSD=1.1%（n=9）。

2.9 尼可地爾雜質檢測限、定量限的測定

在選定的色譜條件下，按信噪比為3對最低檢測限進行測定，結果表明：尼可地爾酰化物的濃度為5.20×103μg/mL，進樣量為10μL時，最低檢測限量為0.2ng。N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯的濃度為1.53×103μg/mL，進樣量為10μL時，最低檢測限量為0.5ng。按信噪比為10對最低定量限進行測定，結果表明尼可地爾酰化物的濃度為1.52×102μg/mL，進樣量為10μL時，最低定量限量為0.5ng。N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯的濃度為4.55×102μg/mL，進樣量為10μL時，最低定量限量為0.9ng。其他未知雜質的檢測限和定量限以尼可地爾來進行評價，依次為0.05ng和0.01ng。

2.10 尼可地爾樣品溶液的穩定性測試

取尼可地爾1.0mg/mL樣品溶液存放在冷處分別于0、4、8、12、24和48h進樣測定。記錄有關物質的峰面積，并用歸一化法考察有關物質的含量，結果有關物質含量與初始溶液相比無明顯變化，RSD為1.0%，而且沒有降解產物出現，結果表明，在冷處條件下，樣品溶液在48h內可保持穩定[6]。

2.11 尼可地爾樣品中有關物質測定（表1）

取樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至主成分保留時間的2.5倍。按面積歸一化法計算單一雜質及總雜質的含量，尼可地爾樣品雜質含量測定結果符合歐洲藥典European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia[S]，7.0.ed 規定[7]。

3 討論

試用日常檢驗常用的色譜柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱Purospher C18柱進行測定均可獲得滿意的結果， 說明本法對色譜柱沒有一定的選擇性。

取尼可地爾工作標準品、尼可地爾酰化物工作對照品；N-（2-羥基乙基）異煙堿硝酸酯用溶劑溶解稀釋制成溶液，在200～400nm波長掃描，尼可地爾在254nm處有最大吸收，尼可地爾酰化物在262nm處有最大吸收；N-（2-羥基乙基）異煙堿在273nm處有最大吸收，在254nm處兩個雜質均有較大吸收，所以選擇254nm作為本品有關物質的檢測波長[8]。

實驗結果表明，采用HPLC高效液相色譜法來檢查尼可地爾中的有關物質，尼可地爾中的主成分、各中間體和分解產物均能達到較好的分離，該方法簡便實用方法可以滿足尼可地爾藥物的雜質控制和穩定性研究有一定的參考意義[9]。

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[9] 王守箐.HPLC測定枸櫞酸莫沙必利片的有關物質[J].藥物分析雜志，2011，31（12）：2330-2332.

（收稿日期：2013-11-07）