艾葉揮發油提取工藝的優化

趙志鴻 耿 楠 黃勇勇 吳 芳 李錦玉 王桂芳 張壯麗 張小俊

1.鄭州大學醫藥科學研究院，河南鄭州 450052；2.河南省肝病藥理重點實驗室，河南鄭州 450052；3.鄭州大學藥學院，河南鄭州 450001；4.鄭州大學臨床醫學系，河南鄭州 450001

艾葉為菊科多年生草本植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥葉，全國各地區均產，資源豐富。 現代研究顯示，其主要含有揮發油、甾萜類、黃酮類、香豆素類、多糖及一些小分子成分等[1-3]，其中揮發油、黃酮類為主要有效成分[4-6]。艾葉是我國歷史悠久且臨床常用的中藥材[7]，有溫經止血、散寒止痛、降濕殺蟲等[8]功效，現代實驗表明其具有增強免疫抗感染、平喘鎮咳、護肝利膽、止血與抗凝血及抗自由基等作用[9-11]，揮發油是艾葉的主要藥效成分群之一，提取方法和工藝是揮發油質量和藥理活性的保證，對于艾葉資源的開發利用也具有重要意義。本課題組前期研究發現艾葉揮發油具有抗乙肝病毒作用，并對其化學成分進行了分析[12]，為將其研制成抗乙肝病毒新藥，研究揮發油的提取工藝。水蒸氣蒸餾法適合工業生產推廣，環保、經濟。 本文以正交試驗法[13-14]對艾葉揮發油水蒸氣蒸餾法提取工藝進行優化， 可提高揮發油的收率和質量，降低成本，具有良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

艾葉產地河南省駐馬店，由河南省中醫學院藥學院生藥學科董誠明教授鑒定為菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥葉。使用時粉碎使通過二號至三號篩，混合均勻。

1.1.2 儀器及試劑

揮發油提取器 （相對密度小于1 型）；KDM-4 型電子可調自動恒溫儀（山東菏澤市儀器制刷廠制造）；電子天平AR1530（梅特勒-托利多儀器上海有限公司制造）；蒸餾水（自制）。

1.2 方法

1.2.1 艾葉揮發油的提取方法

參照《中國藥典》2010 年版一部附錄ⅩD 揮發油測定法（甲法）[15]。 取粉碎的艾葉約100.00 g，精密稱定，加蒸餾水適量，浸泡，加熱提取，收集揮發油，計算揮發油得率，密封，冷藏保存。艾葉揮發油得率計算公式：揮發油得率（%）＝A/B×100%。

1.2.2 單因素試驗

分別考察料液比、浸泡時間和提取時間對艾葉揮發油得率的影響。

1.2.2.1 料液比的影響 取粉碎的艾葉約100 g， 精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）分別為：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，浸泡2 h，提取3 h，各條件分別平行3次，考察不同的料液比下艾葉揮發油的得率。

1.2.2.2 浸泡時間的影響 取粉碎的艾葉約100 g，精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）1∶12，浸泡時間分別?。?、1、2、4、6 h，提取3 h，各條件分別平行3 次，考察不同的浸泡時間下艾葉揮發油的得率。

1.2.2.3 提取時間的影響 取粉碎的艾葉約100 g，精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）1∶12，浸泡2 h，提取時間分別為：1、2、3、4、5 h， 各條件分別平行3 次，考察不同的提取時間時下葉揮發油的得率。

1.2.3 正交試驗及最優提取條件的驗證

1.2.3.1 因素水平設計 由單因素試驗結果選擇考察因素為提取時間（A）、料液比（B）和浸泡時間（C），各因素分別設3 個水平，考察指標為揮發油得率，設計三因素三水平的正交試驗。 見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.3.2 正交試驗設計 取粉碎的艾葉約100 g， 精密稱定，按表2 設計的L9（34）正交表進行試驗。

1.2.3.3 最優工藝條件驗證試驗 以優選出的提取條件進行試驗，重復3 次，以RSD 值小于5%為必要條件，確定優化條件下艾葉揮發油的得率。

1.2.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0 對實驗數據進行分析[16-17]，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析進行數據比較，采用t 檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

表2 L9（34）正交試驗表

2 結果

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比的影響

料液比（W/V）分別為：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16時，對應的揮發油得率依次為：（0.350±0.017）%、（0.424±0.013）%、（0.421±0.016）%、（0.414±0.021）%、（0.408±0.014）%，二者關系見圖1。

圖1 料液比與揮發油得率的關系

由圖1 試驗結果看出：在浸泡2 h、提取時間為3 h 的提取條件下， 料液比各水平間的揮發油得率由高到低依次為：1∶10＞1∶12＞1∶14＞1∶16＞1∶8。料液比為1∶10 時得率最高，為（0.424±0.013）%，與料液比1∶8 比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），而與1∶12、1∶14、1∶16 之間比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），即料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 對揮發油的得率并無太大影響，但由于料液比在1∶10、1∶12 時揮發油得率較高，且綜合考慮工業生產成本，選擇正交試驗中料液比的各水平為1∶10、1∶12、1∶14。

2.1.2 浸泡時間的影響

浸泡時間分別為：0、1、2、4、6 h，對應的揮發油得率依次為：（0.343±0.021）%、（0.378±0.014）%、（0.425±0.013）%、（0.417±0.012）%、（0.365±0.022）%， 二者關系見圖2。

圖2 浸泡時間與揮發油得率的關系

由圖2 試驗結果看出：料液比1∶12、提取時間為3 h 的提取條件下， 依艾葉揮發油得率高至低順序的浸泡時間為：2 h＞4 h＞1 h＞6 h＞0 h。 艾葉經浸泡后提取較不浸泡揮發油得率提高。 其中浸泡2 h 的得率最高，為（0.425±0.013）%，約高于不浸泡時得率的23.91%，與浸泡4 h 比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），浸泡時間超過4 h 后，揮發油得率顯著降低，差異有統計學意義（P ＜0.05），浸泡1、2、4 h 揮發油得率較高。 因此，在正交試驗中浸泡時間水平選擇為1、2、4 h。

2.1.3 提取時間的影響

提取時間分別為1、2、3、4、5 h， 對應的揮發油得率依次為：（0.312±0.012）%、（0.365±0.019）%、（0.412±0.014）%、（0.418±0.014）%、（0.420±0.016）%， 二者關系見圖3。

圖3 提取時間與揮發油得率的關系

由圖3 試驗結果看出：在料液比1∶12、浸泡時間為2 h 的條件下，提取時間各水平間的揮發油得率由高到低依次為：5 h＞4 h＞3 h＞2 h＞1 h。 揮發油得率隨著提取時間的增加而增加， 提取時間由1 h 增至3 h時，得率由（0.312±0.012）%增至（0.412±0.014）%，增加約32.05%，且3、4、5 h 得率顯著增加，與2 h 比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。 3 h 后得率間的增加差異無統計學意義（P ＞0.05），5 h 比3 h 僅增加約1.94%，綜合考慮成本，正交試驗中提取時間選擇1、2、3 h 三個水平。

2.2 正交試驗結果與分析

2.2.1 正交試驗

正交試驗結果見表3， 利用正交試驗軟件對表3中的數據進行方差分析，結果見表4。

表3 L9（3）4 正交試驗結果與分析

表4 方差分析表

由表3 得知，RA＝0.096、RB＝0.007、RC＝0.021 各因素主次順序為A＞C＞B，即直觀分析：A 是最重要因素，對結果影響最大，其次是C，B 是最次要因素。 方差分析結果表明： 對艾葉揮發油得率的影響，A 差異有統計學意義（P ＜0.05），B 和C 差異無統計學意義（P ＞0.05）。 兩者結果一致，提取時間是艾葉揮發油得率的主要影響因素。

根據揮發油提取條件的優選原則， 由表3 可知：kA3＞kA2＞kA1，kB1＞kB3＞kB2，kC3＞kC2＞kC1確定艾葉揮發油的最優提取工藝為A3B1C3，即料液比選擇1∶10，浸泡4 h，提取3 h。

2.2.2 驗證試驗

由表5 結果顯示，在優選的提取條件下，艾葉揮發油平均得率為0.416%，RSD=2.64%（n=3）， 實驗重復性好，結果可靠。

表5 最優提取工藝（A3B1C3）下的驗證試驗

3 討論

通過單因素試驗考察并選擇正交試驗各因素水平，用正交試驗對艾葉揮發油水蒸氣蒸餾法提取工藝進行了優選， 對優選出的最佳工藝條件進行了驗證，證明重復性好，方法可行，結果可靠。

揮發油常見的提取方法有水蒸氣蒸餾法、 微波法、溶劑回流法、超臨界流體萃取法等，其中水蒸氣蒸餾法是分析植物中揮發性成分的傳統提取技術，操作簡便、效率較高，適合工業生產推廣，環保、經濟[18-19]。

以水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發油時，揮發油由水介質慢慢浸出，隨水蒸氣蒸出，因此應適當選擇艾葉與水的比例。水量少時，水散作用進行不徹底，艾葉不能被充分浸泡，蒸氣量生成的就少，得油率將受到影響，試驗中當料液比為1∶8 時，上述原因使得揮發油得率不高；料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 時，揮發油得率較高，分析原因可能是水量增大，水與揮發油兩者的接觸界面濃度差增大，更利于揮發油的擴散和溶解，從而使傳質速率得到提高；若加水量過多，會增加耗能，從而使工業生產成本增加，因此試驗中料液比的水平為1∶10、1∶12、1∶14。

艾葉揮發油得率隨提取時間的增加而增加，3 h前揮發油得率增加明顯，3 h 后得率增加緩慢，與艾葉揮發油不斷蒸出后含量的減少有關。

艾葉是我國傳統中藥，揮發油是其諸多藥理活性的主要有效成分群，艾葉揮發油質量的穩定是其藥理活性的保證，因此其提取工藝的研究具有應用價值[20-21]，尤其水蒸氣蒸餾法提取，環保、經濟，適合推廣。

[1] 宋川.艾葉生藥及其化學成分研究[D].昆明：云南中醫學院，2013.

[2] 段蓉.艾葉化學成分的提取、分離與含量測定研究[D].天津：天津中醫藥大學，2011.

[3] 吉雙，張予川，刁云鵬，等.艾葉的化學成分[J].沈陽藥科大學學報，2009，26（8）：617-619.

[4] 劉先華，周安，劉碧山，等.艾葉揮發油體內外抑菌作用的實驗研究[J].中國中醫藥信息雜志，2006，13（8）：25-26.

[5] 侯迎迎.艾葉乙酸乙酯部位抗乙肝病毒活性研究及成分分析[D].鄭州：鄭州大學，2013.

[6] 程慧.艾葉中黃酮類化合物研究進展[J].光明中醫，2014，29（9）：2015-2016.

[7] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：83.

[8] 梅全喜，高玉橋.艾葉化學及藥理研究進展[J].中成藥，2006，28（7）：1030-1032.

[9] 張袁森，張琳，倪娜，等.艾葉的體外凝血作用實驗研究[J].天津中醫藥，2010，27（2）：156-157.

[10] 費新應，余珊珊，韋媛，等.蘄艾提取液抑制免疫性肝損傷大鼠肝纖維化作用的觀察[J].實用肝臟病雜志，2009，12（1）：11-13.

[11] 周英棟，費新應.艾葉的藥理作用研究[J].湖北中醫雜志，2010，32（11）：75.

[12] 趙志鴻，黃勇勇，張小俊，等.河南駐馬店產艾葉揮發油的GC-MS 分析[J].鄭州大學學報：理學版，2013，45（2）：80-84.

[13] 劉瑞江，張業旺，聞崇煒.正交試驗設計和分析方法研究[J].實驗技術與管理，2010，27（9）：52-55.

[14] 姜麗紅，田汝芳，馬宏偉，等.正交試驗優選藏茵香揮發油的提取與包合工藝[J].中藥工藝與制劑，2014，25（23）：2139-2140.

[15] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄63.

[16] 方積乾.生物醫學研究的統計方法[M].北京：高等教育出版社，2007：541-553.

[17] 李艷玲，范艷花，陶偌偈.SPSS16.0 軟件在化學正交試驗中的應用[J].化學教學，2011，6（1）：17-19.

[18] 溫悅.揮發油提取方法研究概況[J].中國藥業，2010，19（12）：84-85.

[19] 張麗珍，詹曉如，胡奕勤，等.四味清口含片中揮發油的微波-超聲輔助協同提取工藝研究[J].中國現代醫生，2013，51（35）：27-30.

[20] 張小俊，趙志鴻，張壯麗，等.艾葉頂空萃取的揮發油指紋圖譜[J].中成藥，2014，36（6）：1222-1249.

[21] 王緒穎，陳彥，張振海，等.化學與藥效學指標相結合改進痛經寶顆粒中揮發油提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（9）：15-21.