膀胱癌DNA甲基化的研究進(jìn)展

田俊波，董自強(qiáng)，曾 文，梁 云

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443003)

膀胱癌DNA甲基化的研究進(jìn)展

田俊波，董自強(qiáng)，曾 文，梁 云

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443003)

在惡性腫瘤中，相關(guān)的癌基因或抑癌基因由于異常的甲基化導(dǎo)致了其表達(dá)的升高或降低這一生物學(xué)改變普遍存在。膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)腫瘤中死亡率和復(fù)發(fā)率很高的惡性腫瘤，其相關(guān)基因的甲基化狀況也是很多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，本文將就其相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

膀胱癌；DNA甲基化；惡性腫瘤

DNA甲基化（DNA methylation）是一種表觀遺傳修飾，該種修飾影響著DNA和其他分子的相互作用，并且通過細(xì)胞分裂和增殖遺傳。它在胚胎的早期發(fā)育、干細(xì)胞的分化和特定組織的基因表達(dá)起著重要的作用[1]。越來越多的研究表明，DNA甲基化異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，因此，DNA甲基化與膀胱癌的研究成為了近年來的研究重點(diǎn)。

1 DNA甲基化的生物學(xué)特點(diǎn)

DNA甲基化即CPG雙核苷酸上胞嘧啶的第五位碳原子經(jīng)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶。在真核DNA中，5-甲基胞嘧啶是一種很常見的堿基修飾，而且在CPG雙核苷酸序列上包含了90%的甲基化位點(diǎn)[2]。在人類基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)，CpG相互聚集，稱為CpG島(CpG islands)。CpG島一般至少長為0.5 kb，其中富含G:C和CpG內(nèi)容，并且發(fā)現(xiàn)了大約70%的人類基因啟動(dòng)子[3]。在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中其基因的CPG島甲基化狀況絕然不同，前者幾乎大部分處于非甲基化狀態(tài)，后者則常表現(xiàn)為異常甲基化。DNA甲基化模式以發(fā)育階段和細(xì)胞分化為特征，也本質(zhì)的與多發(fā)病變相關(guān)聯(lián)，已經(jīng)成為了惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志[4]。

2 膀胱癌與DNA甲基化的關(guān)系

在腫瘤的形成過程中常常伴有DNA異常甲基化的改變，一般分為CpG島DNA高甲基化和全基因水平DNA低甲基化這兩種狀況[5]。很多基因的CpG島異常甲基化伴隨著膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，在膀胱癌的組織標(biāo)本、膀胱癌細(xì)胞系、患者尿液標(biāo)本中檢測多種基因的異常甲基化。

3 相關(guān)DNA甲基化與膀胱癌發(fā)生的機(jī)制研究

3.1 人類RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Human runt-related transcription factor 3，RUNX3)RUNX3是RUNX基因家族成員之一，它定位于人染色體1號(hào)斷臂1p36，具有很強(qiáng)的腫瘤抑制活性，并且參與了上皮細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)控，目前在很多人類的實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)了RUNX3基因失活的狀況。在轉(zhuǎn)化因子TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)過程中，RUNX3起著至關(guān)重要的作用，TGF-β主要調(diào)控細(xì)胞周期的G1期，減弱TGF-β的敏感性能引起與細(xì)胞凋亡相關(guān)的生長停滯[6]。Jeong等[7]研究觀察到，在非肌層浸潤性膀胱癌(Non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)患者中，RUNX3啟動(dòng)子甲基化發(fā)生在腫瘤樣本中的比率是69%，而在其鄰近的正常膀胱上皮中是47%。Kaplan-Meier評估分析在NMIBC患者中，正常鄰近膀胱上皮RUNX3基因甲基化與病程進(jìn)展呈時(shí)間顯著相關(guān)(P=0.017)。提示RUNX3基因參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，RUNX3啟動(dòng)子甲基化狀況有望成為膀胱癌預(yù)后的生物標(biāo)記。

3.2 死亡相關(guān)蛋白激酶1(Death-associated protein kinase-1，DAPK)DAPK是一種依賴鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的蛋白激酶，位于人染色體9q34，是一種正性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因，其低表達(dá)或缺失是參與細(xì)胞癌變的重要機(jī)制之一。Zbigniew等[8]用MSP法在膀胱原位癌標(biāo)本中有64.3%(27/42)檢測到了DAPK的異常甲基化，而在其對照組患者的血清樣本中并未發(fā)現(xiàn)DAPK的甲基化。同時(shí)，DAPK基因的高甲基化在膀胱癌G1期患者比率為71.4%，處于G2、G3期患者的比率為55%，提示DAPK基因的高甲基化與病理分級分期具有顯著差異且相關(guān)。

3.3 長散在重復(fù)序列1(Long interspersed nuclear elements1，LINE1) LINE1是一種分布在人類基因組中的內(nèi)源性的易變基因序列，它占據(jù)整個(gè)人類基因組的5%，其具備核酸內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄酶的活性。LINE1啟動(dòng)子區(qū)低甲基化能引起其反轉(zhuǎn)錄活性激活導(dǎo)致抑癌基因的失活，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生，這一現(xiàn)象在與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的抑癌基因APC中很常見[9]。LINE1序列的低甲基化現(xiàn)象出現(xiàn)在多種腫瘤中，包括前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱上皮癌、卵巢癌、惡性生殖細(xì)胞瘤、宮頸癌。因此LINE1基因的低甲基化可以作為腫瘤診斷的標(biāo)記物[10]。Wilhelm等[11]通過對不同年齡和不同吸煙狀況的465例對照組和285例膀胱癌患者的外周血提取基因LINE1的甲基化水平進(jìn)行PCR檢測，并根據(jù)LINE1甲基化水平分組對比，發(fā)現(xiàn)LINE1低甲基化組相對于高甲基化組，患膀胱癌的概率提高了2.08倍，提示LINE1基因的低甲基化與膀胱癌的發(fā)生相關(guān)。

3.4 RAS相關(guān)區(qū)域家族1基因(RASSF1A)作為眾所周知的Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1的A型異構(gòu)體，RASSF1A是一種抑癌基因，它處于人染色體3p21。腫瘤發(fā)生過程與RASSF1A密切相關(guān)，一般是由于其啟動(dòng)子區(qū)的CpG島發(fā)生高甲基化引起了基因的低表達(dá)，導(dǎo)致了RAS抑制效應(yīng)低下[12]。RASSF1A的甲基化已經(jīng)在許多人類的實(shí)體瘤中被發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生頻率波動(dòng)在30%～50%。在Gao等[13]的研究中，為證實(shí)RASSF1A的甲基化對于膀胱癌患者的診斷意義，他們對10個(gè)研究組中包含了543例患者和217例對照者的樣本進(jìn)行了元分析，發(fā)現(xiàn)在尿液和腫瘤組織中檢測到的RASSF1A的甲基化對于膀胱癌來說是一個(gè)潛在的危險(xiǎn)因素，而且在膀胱癌患者患者中RASSF1A的甲基化的概率是對照組的8.4倍。

3.5 P16、P15、P14抑癌基因 這3個(gè)基因是定位于人染色體9p21區(qū)的抑癌基因，其編碼蛋白產(chǎn)物通過激活Rb和P53蛋白產(chǎn)物從而抑制細(xì)胞周期從G1期向S期過渡或者直接引起細(xì)胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[14]，所以這3個(gè)基因的異常甲基化也與膀胱癌的多發(fā)有著很高的相關(guān)性。在Kawamoto等[15]用MSP法對65例患者(其中45例膀胱癌患者和19例膀胱癌復(fù)發(fā)患者)的原發(fā)腫瘤和復(fù)發(fā)腫瘤組織的P16、P14基因的甲基化水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因的甲基化比率分別為17.8%和31.1%，而且相對于表淺性膀胱癌，侵入性膀胱癌的甲基化程度更高，經(jīng)過生存分析顯示P14基因甲基化與患者預(yù)后密切相關(guān)。Chen等[16]通過對臺(tái)灣(104例)、香港(82例)、北京(24例)膀胱癌患者的腫瘤組織用MSP法進(jìn)行p14、p15等一些抑癌基因的甲基化檢測發(fā)現(xiàn)其甲基化比率分別是61.8%(P14)、24.5(P15)、87.5%(P14)，很好地顯示了這些抑癌基因甲基化與膀胱癌的相關(guān)性。

3.6 Wnt抑制因子1(WIF-1)Wnt信號(hào)通路在人類早期發(fā)育、疾病以及惡性腫瘤的發(fā)生中扮演著重要角色，而WIF-1是一種能與Wnt蛋白結(jié)合而抑制Wnt信號(hào)通路的分泌型蛋白拮抗劑，已有研究報(bào)道表明WIF-1的表達(dá)下調(diào)與其啟動(dòng)子的高甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]。Urakami等[18]用MSP法檢測到在膀胱腫瘤組織中WIF-1基因CpG島啟動(dòng)子甲基化比率比膀胱周圍黏膜更高，WIF-1甲基化和WIF-1的mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

4 DNA甲基化與膀胱癌的診斷

尿路細(xì)胞學(xué)檢查以及膀胱鏡是目前應(yīng)用于膀胱癌檢查的最普遍的方法，然而由于尿路細(xì)胞學(xué)檢查敏感性差、膀胱鏡檢查價(jià)格高、有侵入性等缺點(diǎn)，使得它們不能很好的作為一種普查手段。當(dāng)前，基于PCR技術(shù)的DNA甲基化檢測法逐漸成熟，將其應(yīng)用于DNA甲基化的檢測已經(jīng)越來越多。Reinert等[19]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對184例非浸潤性膀胱癌患者的390份尿沉渣細(xì)胞的EOMES、HOXA9、POU4F2、TWIST1、VIM and ZNF154基因甲基化水平檢測，其敏感性在90%左右，特異度在50%左右，該檢測由于只需要患者尿液樣本，易收集無創(chuàng)傷，十分可取。

5 DNA甲基化應(yīng)用于膀胱癌的治療

一些腫瘤的抑癌基因或者癌基因的啟動(dòng)子區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生了甲基化而失活，從而引起腫瘤的發(fā)生，如果DNA的甲基化能被逆轉(zhuǎn)，這些基因便可重新表達(dá)。目前眾所周知的DNA甲基化抑制劑是5-氮胞苷和5-氮-2'脫氧胞苷(5-Aza-CdR)，它們的主要靶點(diǎn)是甲基化轉(zhuǎn)移酶，通過抑制該酶的活性，使目的基因的甲基化程度隨著細(xì)胞分裂周期進(jìn)行性的減少[20]。Christine B Yoo等[21]對膀胱癌T24細(xì)胞用5-Aza-CdR處理后，發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR不僅抑制了T24的生長，還能夠誘導(dǎo)p16的重新表達(dá)。這類去甲基化藥物將在臨床的腫瘤治療中有著廣闊的前景。

6 展望

目前DNA甲基化的機(jī)制在表觀遺傳學(xué)中研究比較深入，很多抑癌基因的異常甲基化都參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。DNA甲基化具有可逆性，這一點(diǎn)既可以用于診斷，也可用于治療。然而，隨著DNA甲基化與膀胱癌關(guān)系的研究日趨深入，還有很多問題，如能否找到更具敏感性和特異性的甲基化基因？能否發(fā)現(xiàn)更多的藥物來預(yù)防甲基化或者逆轉(zhuǎn)甲基化？若這些問題得以解決，也許能給膀胱癌的診斷、治療和風(fēng)險(xiǎn)評估等帶來更好的應(yīng)用前景。

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R737.14

A

1003—6350（2014）02—0228—03

2013-07-10)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.02.0085

董自強(qiáng)。E-mail：dzq8678＠126.com