染料木黃酮抑制腫瘤血管生成的研究進展

王巧煥 趙素芬

·綜述與講座·

染料木黃酮抑制腫瘤血管生成的研究進展

王巧煥 趙素芬

染料木黃酮；血管生成；抑制

大豆中天然存在的黃酮類化合物主要有3種，即大豆甙類(daidzin)、染料木甙類(genistin)、黃豆甙類(glycitin)，其中又以染料木黃酮(genistein)含量最多，活性最強，其化學名為4,5,7-三羥基異黃酮。研究表明genistein作為天然的蛋白酪氨酸激酶抑制劑，具有多種生物學活性，如雌激素樣作用、抗雌激素樣作用、抗氧化和調節細胞周期等，近年來因其顯著的防癌抗癌效果而倍受關注[1-3]。國內外的諸多研究已經證實，genistein在抑制腫瘤血管的生成方面具有顯著的作用，而腫瘤血管生成幾乎存在于腫瘤生長和轉移的每一步中，因此genistein抑制血管生成過程從而抑制腫瘤生長和轉移的作用機制成為近年來的研究熱點[2，3]。其機制和作用途徑綜述如下。

1 蛋白酪氨酸激酶途徑

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)是一類催化ATP上γ-磷酸轉移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白質酪氨酸殘基磷酸化，在細胞生長、增殖、分化中具有重要作用。它可分為受體型和非受體型酪氨酸激酶。其中受體型酪氨酸激酶與腫瘤血管生成關系較為密切，genistein抑制受體型酪氨酸激酶主要通過以下幾個途徑：

1.1 血管內皮生長因子(VEGF)途徑 VEGF是促血管生成中最重要的因子，它的表達及受體的功能是腫瘤生長、侵襲、轉移必不可少的。Luo等[1]在體外研究genistein抑制卵巢癌細胞生長和VEGF的表達時，分別檢測VEGFmRNA、VEGF蛋白的表達，證實了genistein對VEGF具有強大的抑制效應，從而能有效的抑制腫瘤血管的生成。而genistein在體內抑制腫瘤血管生長的功效是通過裸鼠移植瘤模型和雞胚絨毛尿囊膜測定的，試驗中觀察到移植瘤模型中微血管密度顯著減少，證實了genistein在體內也能有效的抑制腫瘤血管的生成。而對于其機制的研究，韓彬等[2]用臍靜脈內皮細胞(HUVECs)為研究對象，在實驗中通過測定caspase-3和PTK的活性，證實HUVECs經VEGF刺激后，PTK活性升高；genistein處理組的ECs凋亡率和caspase-3活力與空白對照組相比分別增加了1.81和1.72倍，與VEGF處理組相比，兩者分別增加了2.01和2.02倍，說明genistein可能是通過抑制PTK激酶活性，誘導VEGF處理的內皮細胞凋亡。但Yang等[3]發現在乳腺癌中ER+/rebB-2+細胞中，低濃度的genistein的雌激素活性作用可以抵消它的PTK抑制作用，因此在應用genistein的抗腫瘤作用時一定要注意其濃度。

1.2 成纖維細胞生長因子(FGF)途徑 目前諸多研究顯示FGF在促進腫瘤血管的生成和生長中具有重要作用。Zhang等[4]在研究aFGF在上皮性卵巢癌中的表達及其信號轉導途徑時發現，40例上皮性卵巢癌細胞中aFGF和FGFR1表達較對照組升高，加入外源性的PKC 和 ERK可以使aFGF和FGFR1表達增加，并且呈劑量依賴性，genistein處理后可以明顯降低外源性的PKC和ERK活性，這說明genistein可能是通過降低PKC和ERK的活性來調節aFGF的表達，從而抑制卵巢癌的血管生成。Rajiv等[5]在研究人類惡性神經母細胞瘤時發現加入genistein后磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)的表達明顯增加，而PTEN的增加可以抑制血管生成及生長因子的調節基因N-Myc，N-Myc在腫瘤微環境中可以激活血管生成因子VEGF、FGF及侵襲因子基質金屬蛋白酶等，說明genistein可能是通過上調PTEN的表達來中斷VEGF、FGF介導的血管生成信號轉導通路。綜上所述，genistein通過抑制或激活FGF的上游基因，進而抑制FGF的表達，實現對腫瘤血管的抑制。

1.3 轉化生長因子(TGF)途徑 TGF-β是調節細胞增殖的重要因子，在血管生成過程中，TGF-β信號上調是其重要的特征，國內外諸多研究發現genistein可以顯著抑制TGF-β信號傳導途徑，從而抑制腫瘤血管的生成。至于具體機制，Di等[6]在人尿道平滑肌瘤細胞中發現高濃度的genistein(50 μg/ml)可以有效地抑制TGF-β信號轉導途徑，Western blot試驗進一步發現在genistein治療組，activin A 和Smad3 的蛋白表達均降低了，而Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關鍵性作用，激活素(activin)則是TGF-β超家族球蛋白成員之一。Janet等[7]在綜述大量文獻的基礎上指出genistein可以抑制TGF-β→MEK4→p38MAPK→MAPKAPK2→HSP27→MMP-2信號轉導通路，其中已知TGF-β、MAPK 、MMP-2均參與腫瘤血管的生成及腫瘤的侵襲和轉移。由此我們可以推出genistein抑制TGF-β信號通路中的關鍵分子及其家族成員，進而抑制腫瘤血管的生成。

1.4 胰島素樣生長因子(IGF)途徑 眾所周知，IGF可以促進腫瘤血管的生成。Rabiaz等[8]在研究genistein對前列腺癌組織中細胞周期及血管生成的影響時發現genistein明顯降低IGF1mRNA及蛋白的表達。Lee等[9]發現在前列腺癌PC3細胞中genistein治療組可顯著降低IGF-1刺激的G0/G1期細胞生長，genistein還明顯抑制IGF-1R及其下游基因(Src，Akt等)的磷酸化，同時還可降低E-鈣粘蛋白的水平。體內試驗中，genistein對IGF-1同樣有明顯的抑制作用：Curt等[10]在患有前列腺癌的十二周大小的SV-40 Tag大鼠中，分別喂食genistein，resveratrol(白藜蘆醇)，低劑量的genistein+ resveratrol，高劑量的genistein+resveratrol 12周，結果顯示以上藥物對IGF-1均表現為明顯的抑制作用。

2 非酪氨酸激酶途徑

2.1 基質金屬蛋白酶(MMPs)途徑 基質金屬蛋白酶是一種水解酶，它通過降解細胞外基質來促進腫瘤的侵襲和轉移，genistein可以通過抑制MMPs減少血管的生成和降低腫瘤的轉移能力[11]。在genistein作用的前列腺癌細胞PC-3中，genistein在有效降低MMP-9，MMP-2表達的同時，可顯著地下調蛋白酶M、uPAR、VEGF、神經生長因子、TSP、BPGF、LPA、TGF-β、TSP-1和PAR-2的水平，同時上調組織連接生長因子和組織連接活性多肽的表達水平，而以上基因均與腫瘤血管生成和腫瘤轉移有關。在通過隨機抽樣方法獲取的臨床Ⅱ期前列腺癌患者中，genistein治療組MMP2的表達水平明顯低于非治療組[12]。這些發現進一步支持了在前列腺癌中genistein通過抑制MMP-2的活性而抑制癌細胞侵襲的研究報道[13]。Xu等[14]研究發現在前列腺癌中絲裂酶原蛋白激酶激酶-4(MEK4)可以激活刺激MMP2的表達和癌細胞的侵襲，值得注意的是，genistein在毫微摩爾級濃度時即可抑制MEK4的活性，因此genistein可以通過抑制MEK4的活性抑制MMPs和細胞的侵襲。用c-erbB-2轉染的乳腺癌細胞MDA-MB-435中，c-erbB-2、MMP-2、和MMP-9的表達明顯增加，但在genistein治療組中，這些高表達的因子則顯著降低，說明在乳腺癌細胞中genistein通過抑制c-erbB-2最終抑制MMPs的表達也是其抑制腫瘤血管生成的一條途徑。已知TIMPs是MMPs的一種特殊抑制劑，據報道在乳腺癌細胞中，genistein通過下調MMP-9 并上調TIMP-1來抑制腫瘤細胞的侵襲和血管的生長。綜上述，genistein可以通過多條途徑抑制MMPs，進而抑制腫瘤血管的生長及腫瘤的侵襲轉移。

2.2 缺氧誘導因子-1(HIF-1)途徑 HIF-1是一個具有特異性轉錄活性的異源二聚體轉錄因子，通過調控轉錄因子對血管內皮生長因子的表達，抑制腫瘤血管的生成，在腫瘤的形成和浸潤轉移中具有重要意義。在諸多的體外試驗中，Guo等[14]研究發現，genistein可以顯著的抑制前列腺癌細胞PC-3中HIF-1α在細胞核內的堆積；在人卵巢細胞中進一步研究發現，HIF-1是通過磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)AKT信號通路調節VEGF的轉錄活性，最終影響腫瘤血管的生成。而在體內試驗中，Rajesh等[15]在研究黃酮類化合物抑制血管生成及抗腫瘤的分子機制實驗中，通過雞胚絨毛尿囊膜試驗及血管造影方法顯示genistein對血管生成具有強大的抑制作用；他利用分子對接試驗進一步證明了genistein可以通過抑制促血管生成因子HIF、VEGF、VEGFR等受體與配體的結合進而有效的抑制血管的生成。然而，Yu等[16]在研究土槿皮乙酸(PAB)對人乳腺癌細胞MCF-7的凋亡和壞死的影響時發現genistein可以逆轉PAB對MCF-7的誘導凋亡和壞死作用，這說明genistein在臨床應用中應謹慎，尤其和其他藥物聯合應用時。

2.3 環氧化酶-2(cox-2)途徑 cox-2是誘導酶，在各種刺激如生長因子，細胞因子，致癌因子等作用下其表達增加。cox-2高表達的腫瘤組織中微血管的密度明顯多于低表達者。腫瘤中微血管的密度是惡性腫瘤侵襲和轉移等生物學行為的重要指標，研究表明genistein可有效的抑制誘導型的COX-2的表達。研究發現核轉錄因子κB(NF-κB)可以促發cox-2和促炎因子IL-6、IL-1和TNF-α的轉錄，而Ma等[17]在人胃癌細胞系BGC-823中發現genistein治療組COX-2的蛋白水平及NF-κB活性明顯降低，并且呈劑量依賴性，另外，他又進一步證實NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸對COX-2蛋白水平及NF-κB活性的抑制與genistein對二者的抑制作用是一致的。Kham等[18]也發現在小鼠皮膚炎癥中genistein可以顯著地抑制NF-κB途徑，顯示出強大的抗炎抗腫瘤活性。對于其進一步機制的探討，Ma等[17]在研究genistein增強三氧化二砷抗肝細胞性肝癌中Akt與NF-κB轉導通路時發現genistein在體內可以下調PI3K-AKT，NF-κB及其基因調控產物COX-2、cyclin D1、Bcl-2、Bcl-xL、VEGF等，最近研究顯示PI3K-AKT可以通過增強P65亞單位的轉錄活性進而激活NF-κB，而在胰腺癌細胞中[18]，也有報道證實genistein通過抑制Notch-1的活性而使NF-κB及細胞生長被抑制[17]。綜合以上實驗及發現說明genistein可能是通過NF-κB途徑抑制COX-2的蛋白表達。

2.4 絲氨酸蛋白酶尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)途徑 uPA在許多癌癥中表現為過度表達，uPA-uPAR系統通過與細胞表面的分子(整合素、玻璃體結合蛋白等)相互作用以及激活相關的信號轉導通路，參與腫瘤的增殖、侵襲、轉移及血管的生成等。據報道genistein在前列腺癌細胞和TRAMP小鼠中均可抑制uPA的生成。Han等[19]在胰腺癌細胞系Panc-1 中發現，genisten可以通過下調uPA及MMP-2的mRNA和蛋白水平，進而抑制TGF-β介導的細胞侵襲及轉移，其進一步的分子機制genistein可能是通過Smad4依賴性或非依賴性途徑(p38 MAPK )調節腫瘤活性。總之，以上體內外研究表明uPA-uPAR信號轉導途徑可作為genistein抗腫瘤的作用靶點。其抗腫瘤血管生成和轉移的機制尚需進一步的探究。

2.5 微小RNA(miRNA)途徑 miRNA是近年來研究的熱點。目前已在人類基因組中鑒定出700多種，參與調控約30%的基因表達和翻譯。最近研究表明miRNA 通過調控細胞增殖、分化、凋亡、應激反應等，不僅在腫瘤的生長、侵襲、轉移中發揮重要作用，而且在血管新生過程中也具有不可輕視的地位[20，21]。熊建寧等[20]成功構建了血管內皮生長因子miRNA 表達載體，證實genistein在體外能有效抑制 HepG2 細胞血管內皮生長因子基因表達。Liu等[21]采用雞胚絨毛尿囊膜試驗證實在人前列腺癌細胞DU145中高表達的miRNA-21誘導腫瘤血管的形成。其機制為miRNA-21可以靶向抑制PTEN的表達，并且部分激活PI3K/Akt、ERK1/2信號轉導通路，進而促進腫瘤血管生成關鍵分子HIF-1a、VEGF 的表達。而Zaman等[22]在有關腎癌的體內外試驗均證實genistein可以有效的抑制miRNA-21的表達，體內試驗組其表達下降了40%。因此，genistein抑制miRNA水平也將是其抑制腫瘤血管生成的一條有效途徑。

2.6 其他途徑 Genistein抑制腫瘤血管的生成還包括其他方面，如抑制促血管生長因子溶血磷脂酸、蛋白酶M、腫瘤相關的巨噬細胞、血小板反應素、骨來源的生長因子、蛋白酶活化受體-2、肝細胞生長因子、ROS、神經纖毛蛋白等，同時上調結締組織激活多肽，結締組織生長因子等。

綜上所述，腫瘤血管的形成在實體腫瘤的生長過程中至關重要，而腫瘤血管的生成又是一個復雜的多步驟過程，genistein對腫瘤血管的抑制分為蛋白酪氨酸激酶途徑和非蛋白酪氨酸激酶途徑，但是途徑中具體機制仍不十分清楚，尚需進一步研究。但是我們相信genistein作為一種天然無毒的植物類化學藥物，無論是其單獨應用還是與其它化療藥物聯合應用，都將為臨床腫瘤的預防和治療提供一個良好的前景。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.14.045

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