綠茶提取物EGCG抑制致齲菌變形鏈球菌生長、產酸的實驗研究

陳秀蘭

(咸寧市中心醫院口腔科，湖北咸寧437100)

齲病俗稱蟲牙、蛀牙，是細菌性疾病，可以繼發牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和頜骨炎癥。如不及時治療，病變繼續發展，形成齲洞，終至牙冠完全破壞消失，其發展的最終結果是牙齒喪失。齲病特點是發病率高，分布廣。現已證實，變形鏈球菌(S.mutans)是引起齲齒的重要病原菌，其通過粘附于牙面獲得性膜上，繁殖、產酸，溶解牙體硬組織，形成齲洞。茶多酚是茶葉中一類以兒茶素為主體的多酚類化合物，是茶葉水溶液提取物的主要成分。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體，是茶多酚生物活性的主要成份。研究顯示，綠茶中兒茶素對引起人體致病的部分細菌有抑制效果，本實驗的目的就是研究綠茶提取物茶多酚對變形鏈球菌生長、產酸能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 EGCG購自Sigma公司，變形鏈球菌購自武漢大學口腔醫學院口腔醫學工程教育部重點實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌液的準備 細菌復蘇及培養:將變形鏈球菌干菌株復蘇并接種于腦心浸液瓊脂培養基(Brain Heart Infusion，BHI)，在37℃厭氧環境下(CO210%、N290%)培養48h，經形態學鑒定后挑取接種于BHI液體培養基中培養48h增菌，使用BHI液體培養基調節菌液濃度，使其達到5×106CFU/ml，備用。

1.2.2 抗菌藥物EGCG混懸液的配制 EGCG用BHI液體培養基配制成0.1%的母液，經0.22μm微孔濾膜過濾除菌后于4℃避光保存，使用前按設定濃度(100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5 mg/L)用BHI培養基稀釋后使用。

1.2.3 抑菌環試驗接種 取直徑為5mm的無菌干燥的濾紙，滴加EGCG混懸液20μl，將濾紙片平放于清潔的無菌平皿中，置室溫下自然干燥備用。陰性對照樣片的制備方法相同，只是滴加的是同等體積的無菌生理鹽水。以無菌棉分別蘸取已制備好的變形鏈球菌液均勻涂布于BHI瓊脂平板表面，涂布4次，每次旋轉平板 90°，最后沿平板邊緣涂抹1圈，置室溫干燥5 min。用無菌鑷子將含不同濃度藥紙物的紙片貼于含菌平板上。將平板置37℃恒溫箱中培養48 h，用游標卡尺測量培養皿中的圓形抑菌區域直徑并取得平均值。

1.2.4 EGCG對變形鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)用BHI培養液按液體二倍稀釋法進行等倍稀釋，配制濃度為 100、50、25、12.5、6.25、3.13mg/L各9ml置于無菌試管中。在每管中加入1ml菌懸液，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。陰性對照組試管中為BHI培養基9ml，1ml菌液，空白對照組試管中為10ml BHI培養基。每組5個平行樣。以肉眼觀察藥物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的最低抑菌濃度。

1.2.5 EGCG對變形鏈球菌的產酸抑制作用根據EGCG對變形鏈球菌的MIC測定結果，選取MIC值以下的4個濃度(1、1/2，1/4和1/8 MIC)，配制成含1%蔗糖的BHI培養液，對照組為不含EGCG的BHI培養基，每組5個平行樣。采用精密pH計調定初始pH為7.4，各組按菌懸液和BHI液體培養基1∶10比例接種等量菌懸液，厭氧培養48h，測定上清液pH值，每管測定3次，結果取平均值，并計算pH變化值(△pH)。

1.3 統計學分析 各濃度藥物對細菌產酸抑制作用的研究數據采用SPSS13.0統計軟件分析，多組均數間比較選用單因素方差分析，多組間均數兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度EGCG對變形鏈球菌的抑菌圈大小 結果顯示 100mg/L、50mg/L、25mg/L和12.5mg/L EGCG對變形鏈球菌的抑菌圈的直徑大小分別為14.02±0.98、12.98±0.77、11.54±0.62和10.12±0.37mm。單因素方差分析及LSD-t檢驗結果顯示均數間兩兩比較差異存在顯著性(P＜0.05)。

2.2 肉眼觀察EGCG對變形鏈球菌的最低抑菌肉眼觀察EGCG對變形鏈球菌的最低抑菌濃度為6.25 mg/L。

2.3 不同濃度EGCG對變形鏈球菌產酸的抑制作用 結果顯示兩實驗組(6.25 mg/L、3.13mg/L)△pH值均小于對照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。并且多組間均數兩兩比較顯示6.25 mg/L、3.13mg/L兩組之間差異存在顯著性(P＜0.05)。

3 討論

茶是我國最早發現的中草藥之一。中醫認為，綠茶性苦寒，具清熱解毒，去火降暑 、利尿消炎、消毒殺菌和止渴生津的功效［1］。綠茶提取物的主要成分包括茶多酚、碳水化合物以及多種維生素等，EGCG是茶多酚最主要的活性成分。目前許多研究證實，綠茶提取物具有降血壓、抗凝血、降血糖、減肥、防治動脈粥樣硬化、預防皮膚過敏效應等多種藥理功能。除此之外，還能預防齲齒、牙周炎、口臭等功效［2］。埃及科學家在2008年3月舉行的普通微生物學第162次會議上說，飲綠茶可幫助抗菌素殺傷對抗菌素有極強耐受性的超級細菌，使這些抗菌素效力提高3倍以上。報告顯示接受抗菌素時喝綠茶是耐受菌，甚至是超級耐受菌對幾乎所有受試抗菌素的抵抗力降低。本實驗證實綠茶提取物EGCG具有抑制齲齒主要病原菌變形鏈球菌增殖的作用。抑菌圈實驗結果表明EGCG對變形鏈球菌有顯著的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑菌圈直徑越大，提示藥物濃度與抑菌作用呈正相關趨勢。最低抑菌濃度為6.25 mg/L，說明當只要藥物濃度≥6.25 mg/L就能顯著抑制變形鏈球菌的增殖。除此之外，本實驗還檢測了不同濃度EGCG對變形鏈球菌產酸能力的影響。結果顯示當濃度≥3.13mg/L時，EGCG對變形鏈球菌產酸有一定的抑制作用，當藥物濃度≤1.56mg/L時，實驗組與對照組的△pH相比較差異沒有統計學意義。

由此可見，綠茶提取物EGCG具有顯著抑制變形鏈球菌增殖、產酸的作用。EGCG可能是一種潛在的天然抗菌、防齲藥物。中國是產茶大國，以茶葉為原料提取茶多酚極具特色和優勢，作為茶葉生產的新型副產品，具有相當大的經濟效益。

［1］顧謙，陸錦時，葉寶存.茶葉化學［M］.合肥:中國科學技術大學出版社，2005:348

［2］孫樹國.綠茶提取物市場前景廣闊［J］.食品開發，2013，28(2):42