TGF－β對AngⅡ調節人成纖維細胞Toll樣受體2表達中的影響

胡藝瓊 方玲 郭昌云 劉先哲 余旻 鮑容輝 李冠蘭 滕林 余靜

國內外實驗已證明 AngⅡ與TGF－β關系密切，AngⅡ能促進多種細胞中TGF－β的表達。AngⅡ修飾動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中炎性反應的許多步驟而影響AS的發展［1］。大部分學者認為TGF－β在AS中起保護性作用，即抑制AS中炎癥的發生，延緩AS的發展，活化的 TLR2促進內膜粥樣斑塊的形成［2－4］。本課題前期實驗已經證實了AngⅡ能夠上調體外培養的HT－1080中TLR2表達。本次試驗首次采用TGF－β和TGF－β的抑制劑Decorin刺激體外培養的人成纖維細胞，觀察TGF－β在AngⅡ促TLR2表達中的影響，從而在分子水平上探討AS的發病機制，并為臨床治療AS提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 HT－1080細胞(人成纖維細胞)(武漢典型培養物保藏中心細胞庫)，Dulbecco改良Eagle培養基DMEM(GIBCO)，小牛血清(杭州四季青生物技術有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，血管緊張素II(Sigma公司)，TGF－β(PeproTech Asia公司)，TGF－β抑制劑Decorin(R＆D公司)，Trizol試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司;實時定量PCR各種試劑均購自 Promega;DNA Maker購自 TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 HT－1080的傳代培養及分組:收到定購的細胞后先將培養瓶內的培養液在超凈工作臺內用吸管全部吸出，置于另一無菌容器，再向培養瓶中加入1 ml胰蛋白酶，37℃消化直到細胞脫落，換新的培養瓶，加入吸出的培養液，在37℃，5%CO2培養箱培養，當細胞生長到90% 以上單層融合狀態時，即可加入胰蛋白酶進行消化，按1∶2進行傳代培養。細胞分為:①正常對照組:取2瓶處于對數生長期的HT－1080細胞進行1∶2傳代(傳代后調節細胞濃度為104/ml，每瓶接種細胞懸液5 ml)，正常培養至24 h。②陰性對照組:取2瓶處于對數生長期的HT－1080細胞進行1∶2傳代(傳代后調節細胞濃度為 104/ml，每瓶接種細胞懸液4.4 ml)，待細胞貼壁后(約傳代后4 h)每瓶細胞分別加入高壓滅菌的PBS溶液100 μl，培養4 h后每瓶細胞內加入高壓滅菌的三蒸水500 μl，繼續培養至24 h。③AngⅡ刺激組:取2瓶處于對數生長期的HT－1080細胞進行1∶2傳代(傳代后調節細胞濃度為104/ml，每瓶接種細胞懸液4.4 ml，小牛血清濃度為10%)，將其中4瓶細胞加入高壓滅菌的PBS溶液100 μl，恒溫培養0.5 h 后 4 瓶細胞分別加入 10－3、10－4、10－5、10－6mol/L的 AngⅡ溶液 500 μl(AngⅡ加入培養瓶后分別濃度變為 10－4、10－5、10－6、10－7mol/L)，繼續培養至24 h。④TGF－β刺激組 取2瓶處于對數生長期的HT－1080細胞進行1∶3傳代(傳代后調節細胞濃度為104/ml，每瓶接種細胞懸液4 ml，小牛血清濃度為10%)，將其中四瓶細胞分別加入 TGF－β100、10、1、0.1 μg/L 500 μl，恒溫培養 0.5 h 后四瓶細胞加入高壓滅菌的三蒸水500 μl(TGF－β加入培養瓶后分別濃度變為 10、1、0.1、0.01 μg/L)繼續培養至 24 h。⑤Decorin+AngⅡ刺激組取2瓶處于對數生長期的HT－1080細胞進行1∶3傳代(傳代后調節細胞濃度為104/ml，每瓶接種細胞懸液4.4 ml，小牛血清濃度為10%)，將其中四瓶細胞分別加入 80、40、20、10 μg/ml的Decorin溶液100 μl，培養4 h后每瓶細胞內加入10－5mol/L 的 AngⅡ溶液 500 μl(AngⅡ濃度變為10－6mol/L)，繼續培養至24 h。

1.2.2 RT－PCR各組細胞按照上述分組方法處理后收集并提取總RNA采用Trizol試劑一步法抽提，并對抽提的RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，以確定RNA的純度及完整性。RT－PCR采用兩步法:各組 RNA 定量2 μg、5 × 逆轉錄緩沖液4 μl、100 mmol/L二硫代蘇糖醇(DTT)1 μl、100 μmol/L Oligo(dT15)1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl加 DEPC 處理水至總體積為18 μl，稍離心65℃溫育5 min后置于冰上，加入逆轉錄酶(MMLV)逆轉錄酶(100 U/μl)2 μl，37℃ 逆轉錄60 min，94℃ 5 min滅活逆轉錄酶。PCR反應體系:0.5 mmol/L dNTP 1 μl、10 × PCR 緩沖液 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.4 μl、滅 菌 三 蒸 水 9.6 μl、反 轉 錄 產 物 2 μl、4 μmol/L 上游引物 1 μl、4 μmol/L 下游引物 1 μl、Taqma探針 1 μl。PCR 反應條件為:預變性 94℃3 min、變性95℃10 min 1個循環，退火95℃ 15 s、延伸56℃ 1 min 40個循環。TLR2上游引物序列:5’－CTACTGGGT GGAGAACCTTATGGT－3’，TLR2 下游引 物 序 列:5’－CCGCTTATGAAGACACAACTTGA－3’，cDNA長度 77 bp，TLR2 探針序列:5’－CAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCC－3’;GAPDH 上游引物序列:5’－GAAGGTGAAGGTCGGAGTC－3’，GAPDH 下游引物序列:5’－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3’，cDNA 長度 225 bp，GAPDH 探針序列:5’－CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC－3’。PCR產物在2.5% 瓊脂糖凝膠電泳(90 V，20 min)，Gene Genius凝膠分析系統成像(反應體系由試劑公司提供，上兩屆師姐完善后留下的)。MMLV一般溫度較低，最適溫度是37℃;amv是42～55℃。

1.3 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以表示，先進行數據的正態分布檢驗，方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陰性組TLR2基因的表達量與空白對照組基本相等(P＞0.05)。見圖1、2。

圖1 空白組和陰性組TLR2基因表達的對比

圖2 TLR2 PCR產物電泳圖

2.2 AngⅡ作用于體外培養的HT－1080后發現:該組細胞內TLR2的基因表達量高于空白對照組(P＜0.05)。見表1、圖3。

表1 AngⅡ對TLR2基因表達的影響±s

表1 AngⅡ對TLR2基因表達的影響±s

注:空白組比較，*P＜0.01

空白組 陰性對照組 AngⅡ0.1 μmol/L AngⅡ1 μmol/L AngⅡ10 μmol/L AngⅡ100 μmol/L 1±0.282 1.123±0.130* 3.437±0.373* 4.882±0.388* 5.104±0.25* 5.629±0.288*

圖3 AngⅡ組TLR2PCR擴增產物

2.3 TGF－β作用于體外培養的HT－1080后發現:該組細胞內低濃度(0.1、0.01 μg/L)TGF－β 促進 TLR2 的基因表達，且表達量高于空白對照組，高濃度(1.0、10 μg/L)TGF－β抑制 TLR2的基因表達，且表達量低于空白對照組(P＜0.05)。見表2、圖4。

表2 TGF－β對TLR2基因表達的影響±s

表2 TGF－β對TLR2基因表達的影響±s

注:與空白組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

空白組 陰性對照組 TGF－β0.01 μg/L TGF－β0.1 μg/L TGF－β1.0 μg/L TGF－β10.0 μg/L 1±0.282 1.123±0.130 4.564±0.333# 2.393±0.15# 0.856±0.065* 0.584±0.056#

圖4 TGF－β組及Decorin+AngⅡ組TLR2 PCR擴增產物

2.4 TGF－β抑制劑Decorin和AngⅡ聯合作用于體外培養的HT－1080后發現:其TLR2的基因表達量高于空白對照組，其最高表達量高于單用同劑量AngⅡ刺激組的表達量(P＜0.05)。見表3、圖4。

表3 TGF－β的抑制劑Decorin在AngⅡ對TLR2基因調控中的影響

3 討論

AS的炎癥浸潤通常存在于動脈壁的內膜層和外膜層，作為動脈外膜的最主要組成細胞，人成纖維細胞在動物模型中參與了外膜炎性反應。有研究發現外膜成纖維細胞的激活可促使AS早期病灶的形成［5］。

AngⅡ和TLR2在AS的進展中都發揮了重要的作用，但二者在AS中之間存在何種關系還知之甚少。在關于腎素－血管緊張素系統在慢性環孢素腎病中作用的研究中Kyung等［6］發現，AngⅡ能促腎臟中的炎癥因子表達，炎癥細胞浸潤以及TLR2mRNA和蛋白表達。

由以上研究結果，我們推測AngⅡ可促進體外培養的HT－1080中TLR2的表達。本課題前期實驗也證實了AngⅡ能夠上調體外培養的 HT－1080中 TLR2表達。

TGF－β是可由多種細胞分泌多效性細胞因子，在許多生物學過程中都具有重要作用，且發現TGF－β具有激活炎癥反應和抑制炎癥反應雙重作用。在高血壓的病理過程中TGF－β的轉錄及活化被提高，在AS的病理過程中TGF－β的轉錄即活化卻被抑制，是什么原因造成TGF－β被抑制目前還不清楚。是否由于TGF－β在這兩種疾病中的不同遭遇才誘使AngⅡ對這兩種疾病產生不同的影響還未有可知。本實驗發現TGF－β抑制劑Decorin增強了AngⅡ對TLR2基因表達，并且隨著其濃度的增加作用越強，TGF－β直接刺激組觀察到隨著TGF－β濃度降低TLR2基因表達逐漸增強，由此我們推斷TGF－β在低濃度時可與AngⅡ協同促進HT－1080中TLR2的表達。但另一方面，還需用AngⅡ與不同濃度TGF－β共同作用，這樣才能更加準確地知道TGF－β的作用到底是通過AngⅡ，或其他因子實現的，還是直接影響了 TLR2。目前關于 TGF－β－AngⅡ－TLR2之間調節的具體機制和信號通路還十分模糊，需通過進一步的實驗來證實。

1 Zhong JC，Heikki V，Eero M.AngⅡand vascular inflammation.Med Sci Monit，2005，11:194－205.

2 Dunzendorfer S，Lee HK，Tobias PS.Flow－dependent regulation of endothelial Toll－like receptor 2 expression through inhibition of SP1 activity.Circ Res，2004，95:684－691.

3 Kristina E，Jesper S，G?ran K，et al.Expression of Toll－like Receptors in Human Atherosclerotic Lesions.Cir，2002，105:1158－1161.

4 Adam E，Peter S，Linda K.Curtiss Modulation of atherosclerosis in mice by Toll－like receptor 2.Clin Invest，2005，115:3149－3156.

5 胡維誠.外膜成纖維細胞的激活是動脈粥樣硬化早期事件之一.中國動脈硬化雜志，2007，15:530.

6 Kyung OA，Sun WL，Can Li，et al.Influence of Angiotensin II on Expression of Toll－like Receptor 2 and Maturation of Dendritic Cells in Chronic Cyclosporine Nephropathy.Transplantation，2007，83:938－947.