P16蛋白在宮頸上皮內病變及宮頸癌中的表達及意義

魏 璇 張一兵 杜 雪 馬雪梅 杜秀英

子宮頸癌(cervix carcinoma,CC)是女性生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一，病死率已躍居各類婦科惡性腫瘤之首[1]。本研究采用免疫組化法監測P16蛋白在宮頸上皮內病變、子宮頸癌組織中的表達，以確定其能否作為檢測宮頸癌的生物標志物，以提高宮頸癌的篩查和診斷。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集我院2009年1月-2010年6月宮頸癌石蠟標本65例(其中活檢標本31例，手術標本34例),宮頸上皮內病變CIN組90例(其中CINⅠ30例，CINⅡ30例，CINⅢ 30例)作為實驗組。同時，隨機選取同期因良性病變行全子宮切除的正常宮頸組織30例作為對照組。入選病例既往均無放療、化療及激素治療史。

1.2 主要試劑和方法

P16抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。采用S-P法，免疫組織化學方法參照試劑盒說明進行，以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組化結果判定

P16以腫瘤細胞質或細胞膜呈棕黃色為陽性表達。根據腫瘤細胞陽性數進行判斷，采用高倍視野隨機記數500個腫瘤細胞中的陽性細胞所占比例，分為4級，≤5%為陰性(-)，6%～25%為輕度陽性(+)，陽性細胞數占26%～75%為中度陽性(++),>75%以上為強陽性(+++)。

1.4 統計學處理

應用SPSS 16.0統計軟件,實驗數據采用卡方(χ2)檢驗及Fisher確切概率計算法，以檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸組織中P16的表達

宮頸癌中 P16陽性細胞彌漫型或呈灶狀分布,呈粗大顆粒狀,著色深，呈陽性表達。從正常組織、CIN到宮頸組織癌變過程中，P16蛋白表達逐漸增強，陽性細胞逐漸增多并出現于子宮頸上皮全層，染色范圍與病變細胞呈明顯正相關。在正常對照組、CIN組、宮頸癌組中P16陽性表達率分別為6.7%(2/30)、70.0%(63/90)、100.0%(65/65)；統計學分析差異具有統計學意義(χ2=85.596，P<0.001)。

2.2 P16在CIN組各級別及宮頸癌組中的表達

P16在CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、宮頸癌組的陽性表達率分別為40.0%(12/30)、76.7%(23/30)、93.3%(28/30)、100.0%(65/65)；CIN各組組間相比，CIN各組與宮頸癌組相比差異均有統計學意義(χ2=54.664，P<0.001)。

3 討論

宮頸癌嚴重危害婦女身心健康，其發病機制比較復雜，是多因素參與的多步驟的復雜過程，是從非典型增生、CIN、原位癌再到浸潤癌的漸進過程。研究表明[2]，CIN Ⅰ級發展到CIN Ⅲ級的平均時間為9年，再發展到浸潤性癌則需要3個月到2年，宮頸癌5年存活率為67%，宮頸上皮內瘤樣變存活率為100%，故宮頸癌的早期篩查和診斷是降低發生的關鍵。

在宮頸癌演變過程中，抑癌基因表達失活和癌基因的表達激活是其細胞癌變的分子基礎，在已發現的數個抑癌基因中，P16基因與宮頸癌的關系密切[3]。P16基因是與細胞周期密切相關的抑癌基因，編碼蛋白可與細胞周期蛋白D競爭性結合細胞周期依賴性激酶CDK4/6，干擾CDK4/6與細胞周期蛋白D的結合，阻止細胞從G1期發展至S期，抑制細胞增殖，防止惡性變。有研究顯示許多惡性腫瘤存在P16基因表達異常[4]。但P16在宮頸癌的表達比較復雜，江濤等[5]用免疫組織化學方法研究了102例宮頸組織，其中30例正常宮頸組織中P16蛋白基本為陰性，CIN和宮頸癌組織中P16蛋白的陽性表達率分別為30%和63.5%，Bleotu等[6]研究也證實了這一結果。本實驗顯示在正常宮頸組織向CIN、宮頸癌演變過程中，隨著宮頸病變級別的升高，P16蛋白的陽性表達率逐漸升高，在正常對照組、CIN組、宮頸癌組分別為6.7%(2/30)、70.0%(63/90)、100.0%(65/65)，提示P16的異常表達在宮頸癌的發生發展中發揮重要作用。

P16在宮頸癌中表達增加的原因可能與HPV感染有關[7]，因為宮頸癌患者多伴有HPV感染，HPV病毒表達E7蛋白，E7蛋白與pRb蛋白結合并使之失活，而失活的Rb基因可以反饋性刺激P16表達水平升高。Munoz等在對高危型HPV感染的宮頸癌研究中發現，P16表達與HPVl6/18表達呈正相關[7]，說明P16的過表達是繼發于HPV表達的，提示P16蛋白表達異常是腫瘤發生的早期事件。

綜上所述，P16可作為宮頸上皮的非腫瘤性增生和腫瘤性增生鑒別診斷的標志物。P16蛋白水平對診斷宮頸高度病變有較高的敏感性和特異性。研究結果亦提示P16蛋白檢測可以預測宮頸病變的生物學潛能及其發展的臨床結果，可用于宮頸高度病變的篩查。

[1] Wang SS，Sherman ME，Hildesheim A，et al.Cervical adenocarcinoma and squamous cell carcinoma incidence trends among white women and black women in the United States for 1976-2000〔J〕.Cancer，2004，100(5)：1035-1044.

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[3] 鄒先進，蔡 蘭，劉 穎，等.子宮頸癌前病變與子宮頸癌組織中p16蛋白檢測及其與人乳頭瘤狀病毒感染的關系〔J〕.中華婦產科雜志，2004，39(9)：625-626.

[4] 范 昭，葉 靜，龍 霞，等.P16基因在乳腺浸潤性導管癌中甲基化的研究〔J〕.實用癌癥雜志，2011，26(1)：34-36.

[5] 江 濤，李隆玉，潘 玫，等.p16在宮頸癌組織中的表達及其意義〔J〕.實用癌癥雜志，2005，20(6)：581-587.

[6] Bleotu C,Botezatu A,Goia CD,et al.P16INK4A-A possible marker in HPV persistence screening〔J〕.Roum Arch Microbiol Immunol,2009,68(3)：183-189.

[7] Munoz N，Bosch FX，de Sanjose S，et al.Epidemiologic classification of human papillonlavirus types associated with cervical cancer〔J〕.N Engl J Med，2003，348(6)：518-527.