影響小鼠胚胎時期心臟發育的相關蛋白

蔣靜綜述，都莉審校

(南昌市第一醫院檢驗科，江西 南昌330008)

小鼠胚胎發育中蛋白質隨發育的階段、特定的組織等變遷而不斷發生變化，蘊藏著巨大動態的生命活動信息，利用蛋白質組學技術可從分子水平了解小鼠的發育調控、發育異常等的機制。心臟是胚胎發育的重要器官之一，并且內外環境的改變和高危因素都可能對心臟發育的威脅，其可最終導致多種臨床疾病，尤其是先天性心臟病。心臟疾病是發病率與死亡率均較高的一種疾病，是世界上最常見的死亡原因之一，嚴重地威脅著人類健康。隨著蛋白質組學技術發展，蛋白質組學技術已廣泛應用于心臟疾病研究，如急性冠脈綜合征、擴張型心肌病、先天性心臟病等[1-3]疾病。下面我們探討了相關蛋白對小鼠胚胎時期心臟發育的作用。

心臟是小鼠胚胎發生過程中形成最早的器官之一，胚胎心臟發育經過原始心管的形成和復雜的形態發生最后形成四腔室結構的心，整個過程可人為地分為以下階段：(1)生心細胞誘導和特化期(E7.5d)，起源于生心板；(2)心管形成、環化期(E8.5d～E9.5d)；(3)腔室特化和生長期 (E10.5d～E16.5d)；(4)心后期發育增大期(E16.5d～出生)[4]。 在心臟發育的整個過程中，需要一系列重要的形態發生事件，包括細胞決定、細胞遷移和細胞分化等[5]。小鼠生長發育的過程中其各種轉錄因子、轉化因子、細胞骨架蛋白及細胞凋亡等眾多基因及蛋白在不同時間上的順序表達以保證胚胎心臟形成在時間和空間上的協調性。

1 轉錄因子對小鼠胚胎心臟發育的影響

心臟特異轉錄因子主要是指在心肌細胞中表達的關鍵轉錄活化因子，并且調控編碼心肌細胞結構蛋白或調節蛋白的心臟基因的表達。單個轉錄因子并不能完全控制心臟的生長發育，而是由心臟特異及廣泛表達的轉錄因子的特定組合，如鋅指蛋白GATA4、同源域蛋白Nkx2.5和Thxs以及MADShox蛋白血清反應因子 (SRF)等綜合作用，從而體現了不同的生理過程。

1.1 同源結構域蛋白轉錄因子

1.1 .1 Nkx2.5 Nkx2.5含同源結構域轉錄激活因子，同源結構域有一個螺旋一折疊一螺旋的模體，結合于保守DNA序列T(C/T)AAGTG。在小鼠胚胎7.5d時心臟CSX/Nkx2.5即開始表達，主要表達于心臟生成板內胚和中胚層、咽部中胚層和內臟中胚層等，是心臟最早特異性表達的轉錄因子之一[6]。傳統的Nkx2.5基因敲除小鼠顯示了早期胚胎致死和心管彎曲障礙，與已知的心臟同源盒基因在心臟發生早期的作用相吻合[7]。Nkx2.5缺失的小鼠心肌幾乎不發育，心臟結構停滯在心管彎曲后的初始階段。在Nkx2.5功能異常的小鼠胚胎心臟中，一些心臟基因表達降低，包括MLC2v，ANP，BNP，CARP，MEF2C，Ehand，N-myc，Ixr4 和 HOP[8]，Nkx2.5也參與了Pitx2的轉錄調控復合體上。

1.1 .2 Irx4(Iroquois homeobox gene4)Irx4屬于含有同源結構域轉錄因子的Iroquois家族，為心室特異性同源盒基因，Irx4在整個發育階段均在心室細胞特異表達。lrx4參與了肌球蛋白重鏈基因(MHC)在心室肌細胞特異表達的正調控和負調控。lrx4并不是心室特異性基因表達的全局調控因子，因為破壞小鼠的lrx4僅干擾部分心室特異性基因的表達，包括減少eHAND在胚心中的表達和出生后心房肽(AN)在心房中去阻遏。Irx4缺陷小鼠心功能減弱最終發展成心肌病，這強調了維持正常的腔室特異性基因表達對正常心功能的重要性[9，10]。

1.1 .3 pitx2 pitx2是成對同源域蛋白轉錄因子家族的成員，其主要功能是參與調控心房發育的不對稱特征。缺乏pitx2的小鼠只有一個右心房形狀的大心房，與下腔靜脈及肺靜脈連接異常。但最近研究顯示：轉錄因子pitx2沿著早期心管的左側表達，參與了介導從左到右的信號通路。從左到右傳導缺陷的小鼠模型表現了缺失，雙側對稱或者逆轉的pitx2的表達[11]。

1.2 鋅指蛋白轉錄因子

1.2 .1 GATA家族 GATA家族是一類鋅指蛋自轉錄因子，具有結合核酸共同序列w/GATA/R的特性，進化上非常保守。GATA家族成員在調節細胞生長和分化方面起重要作用，目前有GATA4/5/6三個成員在心臟中表達[12]。GATA4/5/6在心肌分化過程中的表達暗示其可能與心內膜、心肌和大血管的形成有關。GATA4是心臟發育過程中的重要轉錄因子，是胚胎發育過程中心臟細胞的早期標志。小鼠胚胎在E7.0d～7.5d時，GATA4可以的中胚層祖細胞中最早檢測到，心管的形成密切相關。GATA4缺失的小鼠胚胎內胚層細胞不能正常分化，腹側遷移受阻，致心臟二分裂[13]，表明GATA4參與心臟中多種組分的發育。轉錄因子GATA4是心臟發生調節網絡中重要的蛋白，調控間充質細胞向心肌細胞的分化增生及心臟的形態發生過程[14-16]。GATA5主要在心內膜細胞中表達，被認為是心臟形成途徑中的看家調節因子，其與下游基因Nkx2.5一起促進許多成心臟基因表達。GATA5在Nkx2.5及其它心臟基因的表達、正常數量的心肌前體細胞的形成、心肌及心內膜形成、心室腔的分化等心臟發育方面，起到極其重要作用[17]。GATA6在中胚層表達，隨后可在心肌及血管平滑肌細胞中表達，在早期發育階段調節心肌前體細胞增殖。

1.2 .2 FOG-2 FOG-2為鋅指蛋白轉錄因子與心臟間隔有關，小鼠缺失FOG-2不會引起細胞的增殖，而是出現類似于法樂氏四聯癥的房室間隔缺損并且伴隨冠狀血管形成障礙。在FOG-2缺失小鼠中強制表達FOG-2可彌補心臟和血管缺損，提示FOG-2在心臟內的靶分子可能是冠狀血管形成的信號[18]。

1.3 Tbox轉錄因子

1.3 .1轉錄因子Tbox1 Tbox1轉錄因子在胚胎發育過程中，參與胚胎早期咽弓動脈的形成，神經嵴細胞的正確遷移和心臟流出道的形成Tbox1是調控心臟發育的主要的轉錄因子。Tbox1基因的突變或缺失會導致不同類型的心臟發育異常。

1.3 .2轉錄因子Tbox5 Tbox5最初在整個心臟中胚層都有表達，在前晚期線形心管形成期梯度表達，直到妊娠中期，只在心房和左心室表達[19]，對房室腔的初始分化和間隔的形成也具有重要作用，并且是手-心綜合征的致病基因。在Tbox5缺陷的小鼠中的研究發現，其連接蛋白表達降低。它可能發揮雙重作用：破壞發育中的傳導系統正常的空間構型，破壞在傳導系統的細胞自主效應。

1.3 .3轉錄因子Tbox18轉錄因子Tbox18是T-box家族的成員之一，是新的祖細胞標記因子，具有誘導多向分化潛能，對小鼠胚胎期多種器官的發育起重要作用，特別是對胚胎期心臟的發育作用尤為突出。有研究發現[20]：在E9.5d和E10.5d的小鼠胚胎含轉錄因子Tbox18的細胞最初在前體心外膜表達，逐漸向心外膜區域遷移；大于E11.5d的胚胎心臟也有明確而特異地Tbox18表達，表明轉錄因子Tbox18是小鼠胚胎前體心外膜的早期標志之一，對小鼠心臟的發育有重要作用。

1.4 其他轉錄因子 有研究表明，組蛋白乙酰化酶(p300)/CREB結合蛋白(CBP)對胚胎心發育有重要作用[21，22]；p300對整個胚胎心發育尤其是發育早期的生心細胞誘導特化和中期的室間隔形成作用更大。p300和CBP是轉錄共激活因子，在胚胎心發育過程中，它們通過調控胚胎心肌細胞增殖分化相關基因而起作用[23]。轉錄調控因子Pax基因表達的蛋白，它們在胚胎發育過程中對組織和器官的分化起著重要的調控作用，與心肌細胞凋亡有關。

胰島素基因增強子結合蛋白l(Islet-1)是LIMHD蛋白中與心臟相關的亞型，是心肌祖細胞的標志之一。也是心臟發育核心轉錄因子中的關鍵因子。有報道指出[24]：轉錄因子Islet-1可以與p300結合，以蛋白復合物的形式存在，提示轉錄因子Islet-1可能作為樞紐因子募集HATs亞型p300，介導組蛋白乙酰化修飾對心臟發育相關基因GATA4、MEF2C和TBX5調控作用。

ISL-1是第二生心區主要的標志蛋白，在心管早期發育過程中，ISL-1和FGF、BMP、SHH等多種細胞信號及轉錄因子相互作用，調控第二生心區的發育、增生和細胞特異性的保持[25,26]。

有研究發現[27]：大鼠胚胎E15d，HCN4基因在蛋白水平及mRNA的變化在心房和心室均高表達，此后隨胚胎心臟的發育逐漸下降，至P10d后接近成年低表達水平。提示HCN4在心臟不同發育階段的作用不同[28]：胚胎HCN4是真正的起搏因子，成年小鼠HCN4通道的作用可能是參與普通心肌收縮與防止竇性傳導阻滯。

2 轉化生長因子對小鼠胚胎心臟發育的影響

轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)是一種具有多功能活性的生長因子。在胚胎發育期，TGF-β家族參與了早期心前體細胞特化，環狀心形成，心內膜表皮向間充質轉化，心外膜表皮向間充質轉化等過程[29,30]。許多研究認為：TGFβs通過特異的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體介導發揮其生物學功能，在胚胎心臟發育過程中參與上皮一間充質轉化、調節心肌特異性肌球蛋白的表達和心肌細胞的增生和分化[31]。轉化生長因子TGFβs及其受體TβRⅠ和TβRⅡ是胚胎組織和器官發生的重要調節因子，可以促進發育中胚胎心臟心肌特異性蛋白質如：α-平滑肌肌動蛋白，α-肌節肌動蛋白，α-肌球蛋白重鏈和β-肌球蛋白重鏈的表達，在心內膜墊的形成和心臟的分隔過程中起重要誘導作用[32，33]。其中，α-SMA和結蛋白在小鼠胚胎心臟表達的時空差異性表明小鼠胚胎心臟不同部位發育成熟的時間有差異，右心室成熟較慢。α-SMA表達可能與早期胚胎心臟的緩慢蠕動收縮有關，而肌節的發育成熟需要較高的結蛋白表達[34]。

3 細胞骨架蛋白對小鼠胚胎心臟發育的影響

縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)是構成哺乳動物心臟縫隙連接最主要的連接蛋白，為心肌細胞問通訊提供代謝偶聯和電偶聯[35]。主要分布在工作心肌和周圍傳導系心肌，在維持工作心肌與周圍傳導系統的興奮和傳導等方面起重要作用。在胚胎E9.5d時，細胞縫隙連接蛋白Cx43在心臟中開始表達，對于心臟的正常形態發生起著極其重要的作用。對Cx43基因敲除小鼠研究表明，Cx43基因敲除純合小鼠心臟發育畸形[36]，雜合小鼠心臟結構正常，但表現出心室心律失常。在人類，Cx43基岡突變與先天性心臟病密切相關[37]。

Nesprins(Nuclear envelop spectrin repeat)是細胞骨架蛋白家族的新成員，是英國劍橋大學醫學系Dr.Zhang等用差異cDNA篩選和同源檢索尋找血管平滑肌細胞分化標記物過程中發現，由兩個基因編碼的II型完整核膜蛋白[38-40]。Nesprin-1蛋白在心臟發育的各個時期均分布在核被膜和核周間隙，在心臟發育過程中Nesprin-1蛋白無遷移現象。推測核被膜蛋白Nesprin-1可能與胚胎心臟發育過程中傳導系統發育以及收縮功能密切相關。Nesprin-2是Nesprins家族的一個蛋白亞型。研究發現14q23染色體異常可導致致心律失常性右室發育不良 (Arrhythmogenic right ventricular dysplasia，ARVD)[41，42]。 Nesprin-2 在 E12.5d 表達最高，隨著心臟發育呈現逐漸下調的趨勢，這一動態變化可能與心臟傳導系統發育有關。

韌黏素(TN)是一種重要的細胞外基質糖蛋白，Imanaka-Yoshida等[43]研究表明TN-C在胚胎早期發育過程中的心肌細胞分化、原始心管扭轉、心包腔形成房室間隔形成等過程中發揮重要作用。心臟胚胎時期發生發育主要受WNT[44]、骨形態發生蛋白 (bonemorphogenetic protein,BMP)[45]、Notch[46]等信號轉導途徑調控。BMP與Notch信號轉導途徑在胚胎心臟早期發生過程中起關鍵作用。其中，骨形態形成蛋白受體IA(bonemorphogenetic protein receptor IA,BMPR IA，又名ALK3)在心臟發育及心肌細胞的分化中起重要作用，并與室間隔缺損形成有關。

4 細胞凋亡對小鼠胚胎心臟發育的影響

細胞凋亡對于胚胎各器官的正常生長發育有重要作用，而凋亡異常是導致胚胎異常發育的重要因素。一旦發生凋亡紊亂將導致胚胎結構和功能的異常,甚至導致胚胎的死亡及心臟的異常發育。細胞凋亡是一個多步驟并且受基因調控的過程，其包含Bcl-2家族蛋白的調控和caspese的激活，絲氨酸蛋白酶也可能參與這一機制。有文獻報道[47]：小鼠心臟的發育過程中：p53和Bax表達趨勢具有一致性，在E11d~E13d表達較弱，表明此時心臟細胞可能主要處于增殖或者是分化時期。E14d時p53和Bax表達快速增加，達到高峰，且主要分布于心腔側，結合HE染色組織學觀察到此時為心臟體積迅速增大期，此時心在體積增大的同時也是心腔壁細胞大量凋亡、清除多余的細胞，使管腔體積不斷增大的時期，為心臟的功能分化作準備，是心臟塑形關鍵時期。由此可見，細胞凋亡對心臟的正常發育也發揮一定的作用。

5 妊娠糖尿病對小鼠胚胎心臟發育的影響

糖尿病的孕婦子代畸形發生率很高，最常見之一是心臟畸形[48]。有研究表明[49]：高血糖組無論是外觀正常還是畸形胚胎Pax3基因mRNA及蛋白質表達均顯著降低，Cx43基因mRNA及蛋白質表達均顯著升高，說明高血糖引起了Pax3及Cx43基因水平表達的改變，并引起蛋白質水平的改變，從而導致畸形的發生。

胚胎發育各器官蛋白質表達差異，使胚胎的器官結構和生理功能發生了一系列的變化，也更進一步說明了蛋白質與胚胎器官的發育是密切相關的，通過這些研究大大加深了人們對胚胎發育的認識。心臟發育是一復雜的過程，涉及許多蛋白質的參與。心臟疾病相關蛋白質的整體、動態、網絡研究將直接從蛋白質水平來探討心臟疾病發生過程中蛋白質種類和數量變化，從而闡明心臟疾病的發病機制，發現新的生物標志物，為心臟疾病治療提供新手段和思路。同時，為我們了解人類心臟發育相關蛋白的研究提供了基礎，這將有利于人類生殖健康，提高人口素質，進一步為人類的優生打下基礎。

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