乙型肝炎病毒耐藥突變基因檢測在臨床中的應用

許瑞元，王爾莉，曹霜，許玉慧，徐川林

(福建醫科大學附屬漳州市醫院，福建 漳州 363000)

乙型肝炎(HBV)是危害人類身體健康最嚴重的常見傳染病之一，我國是乙型肝炎的高發國家，人群中乙型肝炎表面抗原 (HbsAg)陽性率約為10.0%[1]。其中有2千多萬為慢性乙型肝炎患者。近年來，隨著核苷(酸)類似物的廣泛應用，大部分病人的病情都能夠得到控制，極大程度地改善了患者的生活質量[2]。但長期應用后，易出現耐藥現象，成為當今乙肝治療領域最大的挑戰，研究表明，接受拉米夫定、阿德福韋酯聯合治療5年后，臨床耐藥發生率高，拉米夫定耐藥發生率>60%，阿德福韋酯耐藥發生率>20%[3]。本文對我院門診2012年1月-2013年7月期間123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯合治療5年后，進行核苷(酸)類似物耐藥基因檢測，旨在發現HBV對不同的核苷類藥物的耐藥情況，為臨床藥物治療提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般材料 選取我院門診2012年1月-2013年7月期間123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯合治療5年后的血清標本，男90例，女33例，年齡21~58歲，平均46.5歲。CHB診斷符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。

1.2 標本采集與處理 采集空腹受檢者靜脈血1ml，注入無菌1.5ml離心管中，于室溫靜置2h，轉入 4℃靜置 1h，8000r/min 離心 5min，吸取 200μl上清轉入另一無菌1.5ml離心管中，置于4℃冰箱中待測。

1.3 儀器與試劑 北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司提供的ABI310遺傳分析儀，并使用其專用試劑。

1.4 檢驗方法 完全解凍試劑后充分混勻并3000r/min離心30s。用微量加樣器在每一PCR反應管內分裝20μlHBV PCR反應液。向上述分裝好試劑的PCR管內，加入5μl樣本DNA。將加有標準品、樣本、對照品的PCR反應管按照預先設定好的程序依次置于PCR儀中，進行擴增。反應完畢，根據已知濃度標準品與擴增曲線Ct值之間的線性關系制作標準曲線，從而計算出待檢標本血清中HBV病毒量。取5μl上述制得的PCR產物，再加入2.5μl SAP酶混合物震蕩混勻，3000r/min離心30s，37℃60min,80℃15min，制得PCR酶解產物。取制得的PCR酶解產物3μl、測序試劑1μl和HBV測序引物2μl進行PCR擴增。最后，使用測序分析軟件Chromas對相應耐藥靶點進行結果分析。

2 結果

123 例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯合治療5年后，進行核苷(酸)類似物耐藥的檢測。拉米夫定耐藥84例，占68.29%；阿德福韋酯耐藥25例，占20.32%；替比夫定耐藥12例，占9.76%；恩替韋卡耐藥2例，占1.63%。對不同核苷(酸)類似物有不同耐藥發生率：依次是拉米夫定>阿德福韋酯>替比夫定>恩替韋卡。

3 討論

我國有1億多的乙型肝炎病毒攜帶者，其中有2千多萬為慢性乙型肝炎患者，核苷(酸)類似物是臨床上常用于慢性乙型肝炎抗病毒治療的藥物，它的應用極大地提高了慢性乙型肝炎抗病毒治療水平。但是隨著治療時間的延長，核苷(酸)類似物會出現耐藥。本研究123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯合治療5年后，拉米夫定耐藥達68.29%，阿德福韋酯耐藥20.32%，替比夫定耐藥9.76%；恩替韋卡耐藥1.63%，結果與國外研究一致。目前在我國批準用于乙肝治療有四種核苷(酸)類似物即：拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替韋卡。我國目前常用拉米夫定、阿德福韋酯聯合治療慢性乙型肝炎患者。近年來，隨著拉米夫定、阿德福韋酯長期應用后，易出現耐藥現象。因此，核苷(酸)類似物耐藥的檢測及更加強效快速抗病毒藥物的應用尤為重要。替比夫定、恩替韋卡近年來在我國上市，但也存在耐藥現象[5]。我們的研究結果表明，HBV的耐藥發生率依次為拉米夫定>阿德福韋酯>替比夫定>恩替韋卡，相對于拉米夫定，替比夫定和恩替韋卡屬于強效快速抗病毒藥物。對有抗病毒治療適應證的患者，若選用核苷(酸)類似物應盡量選用抗病毒作用強、耐藥變異發生率低的藥物，同時要了解既往的治療情況，包括核苷(酸)類似物應用情況、治療應答情況及耐藥變異情況，以便選擇無交叉耐藥的藥物治療。治療期間應定期檢測HBV的DNA水平。大量的臨床試驗數據表明，早期病毒學應答情況是預測耐藥發生率的重要指標。所以加強對乙肝病毒耐藥的檢測，及時調整治療方案，以提高療效，降低耐藥發生率是目前應對核苷(酸)耐藥的最佳選擇。

[1]羅超,任娟,高惠,等.乙肝病毒耐藥導致慢性重型肝炎9例臨床分析[J].西南國防醫藥,2010,16(5):4-6．

[2]張兆穎，拉米夫定臨床研究進展[J].抗感染藥學,2005,25(1):33．

[3]EASL Clinical Practice Guidelines.Management of chronic hepatitis B[J].Hepatology 2009,50(2):227-242.

[4]中華醫學會肝病學分會、感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南[J].中華肝臟病雜志,2005,13(12):881-891．

[5]Yim H J，Hussain M，Liu Y,et al.Evolution ofmulti-drug resistant hepatitis B virus during sequential therapy[J].Hepatology,2006,44(3):703-712.