鰱魚致病性嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

萬玉華 彭章華 楊 軍 汪 勇 彭明珍

(1.瀘縣牛灘鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,四川瀘縣 646105; 2.瀘縣畜牧局,四川瀘縣 646100)

鰱魚致病性嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

萬玉華1*彭章華2楊 軍2汪 勇2彭明珍2

(1.瀘縣牛灘鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,四川瀘縣 646105; 2.瀘縣畜牧局,四川瀘縣 646100)

目的:利用實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)對某鰱魚養(yǎng)殖廠發(fā)病鰱魚進(jìn)行診斷,以期為該場發(fā)病鰱魚的治療和預(yù)防提供技術(shù)支持。方法:運(yùn)用細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定對該發(fā)病養(yǎng)殖場隨機(jī)挑取發(fā)病鰱魚進(jìn)行診斷,利用藥敏試驗(yàn)進(jìn)行治療藥物的篩選。結(jié)果:從鰱魚中分離菌株19株,其中13株為嗜水氣單胞菌菌株,檢出率為65.4%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果篩選出的藥物為該病治療和預(yù)防提供了參考依據(jù)。

鰱魚;致病性嗜水氣單胞菌;分離;鑒定

1 材料

1.1 病料來源

隨機(jī)選取15條來自發(fā)病養(yǎng)殖場的鰱魚。

1.2 主要試劑及儀器

普通培養(yǎng)基、AHM鑒別培養(yǎng)基、脫脂奶蔗糖蛋白胨平板、氧化酶試劑、H2O2酶試劑；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒；2×Taq PCR Master Mix；VitekGNI+鑒定卡片。顯微鏡，生化培養(yǎng)箱。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

15～18g健康小白鼠20只。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離和初步鑒定

將抽取發(fā)病鰱魚處死，無菌操作采集其肝臟、脾臟、心血等組織，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板28℃培養(yǎng)18～24h。挑取典型菌落純化培養(yǎng)，革蘭染色鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)，并用純化菌落進(jìn)行氧化酶、過氧化物酶試驗(yàn)。

2.2 培養(yǎng)特性試驗(yàn)

2.2.1 AHM培養(yǎng)基鑒定

將純菌落接種于AHM培養(yǎng)基，28℃過夜培養(yǎng)，觀察顏色反應(yīng)，并作穿刺培養(yǎng)，觀察運(yùn)動(dòng)情況。

2.2.2 主要毒力因子試驗(yàn)

將純菌接種于脫脂奶蔗糖蛋白胨平板28℃培養(yǎng)過夜，觀察脫脂奶平板上菌落周圍是否出現(xiàn)清晰透明的溶蛋白圈，以確定菌體是否產(chǎn)生胞外蛋白酶。

2.3 生化鑒定

采用微量發(fā)酵管法檢測分離菌株生化特性，28℃恒溫培養(yǎng)7d，測定包括糖發(fā)酵試驗(yàn)、氨基酸代謝試驗(yàn)、細(xì)菌酶試驗(yàn)、耐鹽試驗(yàn)等

2.4 人工感染試驗(yàn)

將鑒定為嗜水氣單胞菌的分離株進(jìn)行純培養(yǎng)低速低溫離心后，用無菌生理鹽水懸浮至原體積進(jìn)行小鼠感染試驗(yàn)。小鼠共分成4組，分別為對照組和試驗(yàn)1～4組（5只/組），對照組腹腔接種無菌生理鹽水0.2ml，試驗(yàn)1～3組分別腹腔接種0.2 ml，1組接種濃度為3×104cfu/ml，2組接種為3×105cfu/ml，3組接種濃度為3×106cfu/ml。感染小鼠后，觀察24h內(nèi)發(fā)病情況，死亡小鼠立即剖解。24 h后，處死所有小鼠，無菌操作觀察其主要的病理剖解變化并分離目的菌，培養(yǎng)并鑒定。

2.5 藥敏試驗(yàn)

選取16種藥敏紙片，分別檢測抑菌圈直徑，參照抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)確定各種藥物對病原菌株的敏感性。

3 結(jié)果與分析

3.1 病原菌的分離

分離該疑似嗜水氣單胞菌菌落邊緣整齊、光滑、微凸，呈無色或淡黃色。顯微鏡下觀察為兩端圓形，至球菌狀，單個(gè)、成對或成鏈排列，直徑1.0～4.4μm的革蘭氏陰性短桿菌；以極生鞭毛運(yùn)動(dòng)，一般單鞭毛。分離株分別命名為L1-L19進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 氧化酶試驗(yàn)

19株純化菌在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基28℃過夜培養(yǎng)后，氧化酶試驗(yàn)結(jié)果表明：絕大部分菌株氧化酶試驗(yàn)為陽性。

3.3 AHM鑒別培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：頂部為紫色，底部為淡黃色；細(xì)菌沿穿刺線呈刷狀生長，即運(yùn)動(dòng)力陽性，部分菌株頂部黑色，少數(shù)產(chǎn)有氣泡。

3.4 主要毒力因子檢測結(jié)果

10 g/L脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上菌落周圍出現(xiàn)清晰透明的溶蛋白圈。

3.5 生化鑒定結(jié)果

分離的19株菌株經(jīng)過生化鑒定，其中14株生化鑒定結(jié)果與嗜水氣單胞菌生化特性相近。

3.6 DNA擴(kuò)增序列測定于分析

對分離出的各株純培養(yǎng)分細(xì)菌進(jìn)行PCR反應(yīng)，測序結(jié)果，序列分析表明其中13株菌為嗜水氣單胞菌。

3.7 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)組1～3小白鼠接種后，2、3組小鼠均在24h內(nèi)死亡，1組死亡2只，另外3只小鼠表現(xiàn)為弓背、聳毛、運(yùn)動(dòng)遲緩、食欲不振，雙眼半閉、呼吸急促等癥狀。24后處死所有小鼠，無菌操作解剖死亡及處死小鼠，試驗(yàn)組小鼠分離出目的菌，對照組小鼠24 h無不良反應(yīng)，未分離出目的菌。

3.8 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明。分離菌株對頭孢三嗪、頭孢哌酮鈉、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、呋喃唑酮敏感，對新生霉素、麥迪霉素、鏈霉素、利福平、紅霉素、林可霉素、頭孢拉定、氨芐西林鈉不敏感。

4 討論

（1）從鰱魚中分離的病原菌，觀察其在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落形態(tài)及其在1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上培養(yǎng)菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明溶蛋白圈，AHM鑒別培養(yǎng)基上陽性表現(xiàn)頂部仍為紫色，底部為淡黃色；細(xì)菌沿穿刺線呈刷狀生長部分菌株頂部黑色都與嗜水氣單胞菌相符。對生化鑒定為嗜水氣單胞菌的分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序比對，表明分離菌與嗜水氣單胞菌同屬一個(gè)類群。胞外蛋白酶是嗜水氣單胞菌與其毒素的分泌有密切的關(guān)系，因而對胞外蛋白酶的檢測也作為嗜水氣單胞菌鑒定的重要方面。試驗(yàn)中總共從鰱魚中分離菌株19株，其中為嗜水氣單胞菌的菌株為13株，檢出率68.4 %。對分離的菌株做人工感染試驗(yàn)，

（2）通過藥敏試驗(yàn)篩選出頭孢三嗪、頭孢哌酮鈉、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、呋喃唑酮對該致病性嗜水氣單胞菌具有良好的抑制作用，在該鰱魚養(yǎng)殖場在治療本病的時(shí)可起到指導(dǎo)作用。

（3）對于本病最根本的方法還是預(yù)防為主，防治結(jié)合。養(yǎng)殖場需加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保證良好的水質(zhì)、適宜的養(yǎng)殖密度，在夏季時(shí)注意水溫的控制，清塘?xí)r徹底消毒。同時(shí)要加強(qiáng)平時(shí)對養(yǎng)殖鰱魚應(yīng)隨時(shí)注意觀察，做到早發(fā)現(xiàn)，早治療。發(fā)病后，對未被感染的池子嚴(yán)格進(jìn)行隔離，對發(fā)病鰱魚若存在治療價(jià)值進(jìn)行積極救治，若治療價(jià)值不大，及時(shí)進(jìn)行淘汰處理，并對魚塘進(jìn)行清塘消毒。

[1] 梁婷，丁建華，馮佳，等.鰱魚對浮游植物濾食的選擇吸收[J].當(dāng)代水產(chǎn)，2014，（1）：73-74.

[2] 張舵，蔡懋沅，王柏錚，等.白鰱的養(yǎng)生價(jià)值探討[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：5381-5383.

[3] 沈錦玉.嗜水氣單胞菌的研究進(jìn)展[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，27（1）：78-86.

萬玉華（1972-），女，大學(xué)本科，長期從事動(dòng)物疾病診療。