人參皂苷Rb1對H2O2損傷RGC-5細胞的保護作用及機制探討

李 穎，張秀麗，汪 卓

(1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110001;2濱州醫(yī)學院藥學系;3東北大學生命與健康學院)

青光眼是一類以視神經(jīng)損傷和視野缺損為特征的眼病，已成為不可逆性致盲眼病的第二位疾病，其主要機制與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)凋亡和神經(jīng)纖維的丟失有關，因此對于RGC的保護和再生治療成為當今眼科研究領域的新熱點。人參是傳統(tǒng)的補益中藥，人參皂苷是人參中的主要有效成分。實驗研究表明，人參皂苷Rb1對H2O2誘導的新生大鼠心肌細胞有保護作用［1］。2014年5～8月，我們觀察了人參皂苷Rb1對H2O2損傷RGC-5細胞的保護作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 H2O2、人參皂苷 Rb1、Fluo-3/AM(Molecular Probe)、Caspase-3抗體、SABC 試劑盒(武漢博士德);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);胎牛血清(杭州四季青生物材料工程研究所);DMEM(Gibco公司)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，酶標儀，熒光顯微鏡。

1.2 細胞培養(yǎng) RGC-5細胞采用10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每3～5 d后通過胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞活力觀察 RGC-5細胞以1×105/mL接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，實驗分為5組，E組不制備H2O2損傷模型，也不干預;A、B、C組提前30 min加入0.05、0.1、0.2 mmol/L 人參皂苷 Rb1，A、B、C、D組均加入0.2 mmol/L H2O2誘導氧化損傷24 h，加入終濃度0.5 mg/mL的MTT，37℃孵育4 h后，加入DMSO 100 μL，采用酶標儀在490 nm處檢測細胞OD值(代表細胞活力)。

1.4 細胞GSH含量、SOD活性檢測 RGC-5細胞以1×105/mL接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，空白對照組不制備H2O2損傷模型，也不干預;人參皂苷Rb1組提前30 min加入0.1 mmol/L人參皂苷Rb1，人參皂苷Rb1組及H2O2損傷組均加入H2O2誘導氧化損傷24 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入細胞裂解液100 μL，冰上裂解30 min后，收集上清液并離心，按照GSH含量測試盒說明書設置空白孔、標準孔和測定孔，分別加入不同試劑混勻，靜置5 min，在405 nm處，采用酶標儀測定各孔的吸光度值。按照SOD活性測試盒說明書分別設置對照孔、對照空白孔和測定孔，三孔分別加入不同試劑混勻，37℃孵育20 min，450 nm處酶標儀測定各孔的吸光度值。

1.5 細胞Caspase-3蛋白檢測 分組及各組干預(方法同1.4)后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，4%的多聚甲醛固定室溫10 min，棄固定液后PBS洗滌3次，0.5%Triton-100室溫穿孔5 min，PBS洗滌3次，1%BSA室溫封閉30 min，加入1∶500的 Caspase-3一抗，于37℃孵育2 h，PBS洗滌3次，按照 SABC說明書加入二抗及熒光試劑，同時加入4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚，熒光顯微鏡下觀察Caspase-3免疫反應陽性細胞，并計數(shù)，計算免疫反應陽性細胞百分率(陽性細胞百分率 =陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù) ×100%)。

1.6 細胞 Ca2+檢測 分組及各組干預(方法同1.4)后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，各組細胞用5 μmol/L Ca2+熒光探針Fluo-3在37℃孵育1 h后，熒光顯微鏡下觀察Ca2+熒光強度，并計算陽性細胞百分率(陽性細胞百分率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.7 碘化丙啶(PI)染色細胞檢測 分組及各組干預(方法同1.4)后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，加入終濃度為0.05 mg/mL的PI，室溫染色15 min，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的細胞，并計算陽性細胞百分率(陽性細胞百分率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞活力比較 A、B、C、D、E組在490 nm處OD 值分別為 0.266 ±0.038、0.299 ±0.025、0.314 ±0.014、0.222 ±0.031、0.391 ±0.041，A、B、C、E 組與 D 組比較，P 均 ＜0.05。

2.2 各組細胞SOD活性、GSH含量比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組SOD活性分別為(19.88 ±0.12)、(17.12 ±0.32)、(15.47 ±0.21)U/mgprot，人參皂苷 Rb1組、空白對照組分別與H2O2損傷組比較，P均＜0.05?？瞻讓φ战M、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組GSH含量分別為(15.67±0.18)、(14.98 ± 0.25)、(13.71 ± 0.31)μmol/gprot，人參皂苷Rb1組、空白對照組分別與H2O2損傷組比較，P 均 ＜0.05。

2.3 各組細胞Caspase-3蛋白比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組Caspase-3陽性率分別為 12% ±0.25%、57% ±0.47%、28% ±0.18%，人參皂苷Rb1組與H2O2損傷組比較，P＜0.05。

2.4 各組細胞PI染色陽性率比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組細胞染色陽性率分別為16% ±0.25%、18% ±0.45%、32% ±0.56%，人參皂苷Rb1組與H2O2損傷組比較，P＜0.05。

2.5 各組細胞Ca2+水平比較 空白對照組、人參皂苷Rb1組、H2O2損傷組細胞Ca2+熒光染色陽性率分別為 8% ±0.11%，31% ±1.20%，19% ±0.34%，人參皂苷Rb1組與H2O2損傷組比較，P＜0.05。

3 討論

目前認為，青光眼致視功能損害的共同病理基礎是神經(jīng)節(jié)細胞的進行性死亡和神經(jīng)纖維丟失，導致不可逆性視神經(jīng)萎縮和視野改變，構成青光眼的最終改變，氧化應激引起的RGC凋亡是重要原因之一［2］。研究［3，4］表明，氧化應激可以誘導體外 RGC細胞Casepase依賴性的凋亡。H2O2是有機體氧化代謝產(chǎn)物，是一種活性氧，能直接氧化細胞膜上的脂質及蛋白，能自由穿過細胞膜細胞內離子反應生成活性更強的自由基，H2O2在體外能誘導ROS產(chǎn)生和細胞凋亡，因此被廣泛用于各種急性和(或)慢性氧化損傷模型［5，6］。

人參是一種傳統(tǒng)的藥物，人參皂苷Rb1是近年來研究較多的一類人參單體，其具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增強記憶力等功效［7，8］。研究［9，10］表明，人參皂苷 Rb1 可明顯減少 Aβ25-35 誘導的神經(jīng)細胞凋亡，對神經(jīng)細胞的缺血性損傷有保護作用。由于H2O2在體外能誘導ROS產(chǎn)生，當機體內H2O2增多或者清除能力減弱時，就會產(chǎn)生氧化應激損傷。本研究顯示，隨著H2O2濃度的增高，細胞的存活率降低，當H2O2濃度為0.2 mmol/L時細胞活力最大。通過人參皂苷Rb1干預后，細胞活力明顯提高，提示人參皂苷Rb1對氧化損傷具有保護作用。

機體內存在抗氧化系統(tǒng)包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，SOD是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，通過歧化的方式清除超氧自由基，而GSH是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑［11］。因此，檢測SOD活性和GSH含量可反映機體的過氧化程度。本研究顯示，人參皂苷Rb1組SOD活性、GSH含量較空白對照組降低，較H2O2損傷組升高，提示這個可能是人參皂苷Rb1的保護機制之一。ROS可氧化細胞膜上的脂質，脂質的過氧化物進而引起細胞內的Ca2+失衡［12，13］。細胞內鈣超載在細胞凋亡的過程中起關鍵作用。鈣超載及其所觸發(fā)的一系列有害代謝是導致神經(jīng)細胞死亡的“最后共同通路”細胞內鈣超載可使一些參與細胞凋亡的Ca2+依賴性蛋白酶激活，導致生物膜損傷［14］。本研究顯示，人參皂苷Rb1組Ca2+水平較空白對照組降低，較H2O2損傷組升高，提示人參皂苷Rb1可能是通過細胞Ca2+的調節(jié)對H2O2損傷RGC-5起保護作用。本實驗采用PI染色觀察H2O2是否誘導細胞凋亡，因為PI不能穿過活細胞的細胞膜，而對壞死的細胞由于細胞膜的完整喪失而被著色。本實驗結果顯示，當H2O2作用RGC-5細胞后，PI染色的細胞明顯增多，說明H2O2對RGC-5細胞具有明顯的損傷作用，加入人參皂苷Rb1干預后PI染色的細胞明顯減少，說明人參皂苷Rb1具有抗凋亡的作用。凋亡是一種受基因調控的程序性死亡，Caspase是天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白水解酶是細胞凋亡過程中最關鍵的蛋白酶家族，通常以無活性的酶原形式存在［15］。Caspase-3是Caspase家族中最為重要的凋亡執(zhí)行者之一［16］，是最關鍵的凋亡蛋白酶，當被活化后，酶解、切割特異性底物如DNA依賴性蛋白激酶等，改變其結構或影響特定信號分子而引起細胞凋亡［17］。研究［18，19］表明，高濃度 H2O2能使 Caspase-3 活化，進而導致細胞凋亡。本研究顯示，H2O2誘導損傷RGC-5細胞后，Caspase-3陽性細胞表達率明顯增多，而人參皂苷Rb1能抑制Caspase-3陽性表達率，提示人參皂苷Rb1通過減低Caspase-3的活化進而抑制H2O2誘導RGC-5細胞的凋亡。

總之，人參皂苷Rb1能夠拮抗H2O2對RGC-5細胞的氧化損傷，其機制可能為提高SOD活性和GSH含量，降低Caspase-3的表達，減少Ca2+水平。

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