microRNA與乳腺癌耐藥相關性的研究進展

史 敏, 呂建鑫, 潘 波, 王曉軍, 戴璐嫻, 楊曉紅, 付子毅, 謝 暉

(1. 江蘇省揚州市婦幼保健院 乳腺科, 江蘇 揚州, 225002; 2. 南京市婦幼保健院, 江蘇 南京, 210004)

microRNA(miRNA)是一類長度約21～25 nt的非編碼RNA, 在轉錄后水平調控靶基因的表達[1-2]。miRNA的成熟包括在胞核及胞質中的加工過程，在核酸內切酶Drosha作用下，miRNA的編碼基因由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成具有莖環結構的RNA由核內輸出，經Dicer酶加工形成成熟的miRNA，與Argonaute蛋白結合形成RISC(RNA-induced silencing complex, 基因沉默復合體)，進而調控靶基因的表達[3-4]。miRNA與靶基因的3′-UTR區結合，導致mRNA降解和/或翻譯抑制，下調靶蛋白的表達，從而達到調控靶基因表達的目的[5]。事實上, miRNA調節了約30%的蛋白編碼基因，并參與多種生物學功能的調控，包括細胞增殖、凋亡及分化[6]。因此, miRNA的功能異常與多種人類疾病有關，包括腫瘤[7]在內。近年研究[8]表明, miRNA與多種實體腫瘤的耐藥性密切相關。經對乳腺癌細胞耐藥株及敏感株的研究，證實多種miRNA對乳腺癌多藥耐藥具有調控作用[9-14]。

1 miRNA調控乳腺癌耐藥的機制

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，全球每年約有1.4億新發病例，約有46萬婦女死于乳腺癌，是導致患癌癥婦女死亡的首要原因[15]。近年來，我國女性乳腺癌發病率逐年顯著遞增，遠高于其他國家，并趨于年輕化，嚴重威脅女性的生命健康和生活質量[16]。盡管在過去20年間，通過對疾病篩查的普遍實施和新的治療方法的發展，西方國家的乳腺癌死亡率顯著下降，但對這些治療方法的耐藥成為越來越嚴重的問題[17]，據報道[18]約有90%的乳腺癌患者最終死于耐藥。乳腺腫瘤對結構和功能不同的化療藥物均可能產生多藥耐藥(MDR), 明顯影響化療效果。MDR是指腫瘤細胞在接觸一種抗腫瘤藥物并產生耐藥的同時，對結構、功能及殺傷機制迥異的多種抗腫瘤藥物具有交叉耐藥，是最重要的耐藥形式之一。最新研究[19]表明，MDR已成為乳腺癌治療失敗的關鍵因素。

Iorio等[20]于2005年首次發現，miRNA在乳腺癌和正常乳腺組織中表達存在顯著差異。Ryu等[21]在MCF-710A、MCF-7及MDA-MB-231等不同乳腺癌細胞株中鑒定出189種表達明顯異常的miRNA，且這些miRNA均有不同程度的致癌潛能。后續研究發現，多種miRNA與乳腺癌耐藥相關, miR-221/222在他莫昔芬耐藥的細胞中低表達[22], miR-328在米托蒽醌耐藥的細胞中低表達[23], miR-125在紫杉醇耐藥的細胞中高表達[24]等等。這些證據充分說明: miRNA的表達異常是乳腺癌耐藥細胞的一個重要特征，與乳腺癌耐藥有著極其密切的關系。miRNA對乳腺癌耐藥的調控機制十分復雜，目前并未完全闡明。現今較明確的機制主要包括調節ABC轉運蛋白的表達、調節凋亡通路、調節藥物代謝酶的表達及調節腫瘤干細胞的形成等。

1.1 miRNA對ABC轉運蛋白的調節

乳腺癌患者產生MDR的最主要原因是由藥物外排增加、細胞內藥物濃度下降所致[25]。藥物外排增加受ABC轉運蛋白調節，其在預后較差的乳腺癌各亞型中均表達顯著增加[26]。P糖蛋白(P-glycoprotein)是ABC轉運蛋白中研究最為透徹的與藥物外排有關的蛋白，與紫杉烷類及蒽環類化療藥物耐藥密切相關。P-gp由MDR1基因(ABCB1)編碼，可以轉運多種分子結構，這即意味著只要對一種化療藥物耐藥，通常就會對多種結構不同的藥物耐藥。研究[11，27]表明，miR-27a、miR-451可能上調多藥耐藥基因MDR1及其產物P-gp的表達。另有多項研究顯示，miRNA能以ABC超家族的多個成員如ABCB、ABCG、ABCC等為靶基因，對腫瘤細胞耐藥性進行調控。Pan等[10]研究發現, miR-328在乳腺癌細胞中與ABCG2的表達呈負相關，耐藥細胞株MCF-7/MXl00中, miR-328表達顯著下調，而ABCG2表達顯著上調，導致細胞對米托蒽醌耐藥。Zhou等[24]為進一步闡明miR-328的調控機制，分別檢測轉染miR-328的MCF-7/MXl00細胞、轉染miR-328拮抗劑的MCF-7細胞以及破壞ABCG2 3′-UTR區相應miR-328反應元件(MRE)的MCF-7細胞等的ABCG2 3′-UTR的熒光素酶活性，發現其分別下降50%以上、上升100%及上升3倍，這充分證實miR-328是通過與ABCG2 3′-UTR區相應的MRE特異性結合，進而負調控ABCG2的表達。之后的研究[9]證實, miR-519c和miR-520h通過靶向作用于ABCG2 mRNA的3′-UTR區進而調控其蛋白的表達。Pelletier等[14]通過對乳腺癌患者ABCG2 3′-UTR區的檢測，發現miRNA可干擾其多態性，增強與3′-UTR區的結合作用進而影響乳腺癌的MDR。后續研究還發現更多的miRNA以類似機制調控耐藥相關蛋白的表達，如miR-451可負調控P-gP[11]、miR-326、miR-345和miR-7等，均可負調控多藥耐藥蛋白1(MRPl/ABCC1)[13, 28], 與乳腺癌對阿霉素、依托泊苷以及順鉑等化療藥物耐藥性的形成密切相關。miR-200c[29]和miR-298[30]在耐多柔比星乳腺癌細胞中均低表達，當提高其表達量時，可增加乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性并降低MDR1/ABCB1及P-gP的表達，從而提高細胞內多柔比星藥物濃度。說明miRNA通過調節ABC轉運蛋白的表達，從而造成細胞內藥物外排、胞內藥物濃度下降而致乳腺癌細胞耐藥性增強。

1.2 miRNA對細胞凋亡通路的調控

細胞抗凋亡能力的提高是腫瘤細胞多藥耐藥產生的重要機制之一[31]。抗腫瘤藥物通過介導內源性或外源性凋亡反應而使腫瘤細胞死亡。miRNA可通過調控凋亡通路相關蛋白表達，進而影響乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，其表達水平與乳腺癌耐藥細胞中相關的miRNA表達水平密切相關。Cittelly等[32]研究發現，Bcl-2的表達水平與miR-15a、miR-16的表達水平在MCF-7/HER2Δ16細胞中呈負相關，通過分別轉染miR-15a和miR-16后, Bcl-2的表達水平顯著降低，細胞對他莫昔芬的敏感性顯著增強；而通過沉默miR-15a和miR-16, 使Bcl-2的表達顯著增加，細胞的抗凋亡能力及對他莫昔芬的耐藥性均顯著增強，提示miR-15a、miR-16通過下調Bcl-2的表達，進而調控乳腺癌細胞MCF-7/HER2Δ16耐藥性的形成。另有研究[34]證實，miR-125b、miR-221、miR-222和miR-923在耐紫杉醇乳腺癌細胞中高表達，并發現miR-125b與Bcl-2的表達水平呈正相關，均高表達，其機制為miR-125b通過抑制促凋亡基因Bak1(Bcl-2 antagonist killer 1)的表達致細胞內Bak1的表達水平顯著降低，Bak1對Bcl-2的拮抗作用顯著降低，Bcl-2表達水平上調，細胞抗凋亡能力增加，對紫杉醇耐藥性增加。Ru等[33]發現miR-203可直接負調控細胞因子信號抑制因子3(SOCS3)的表達，進而降低了p53、p21、Bax等促凋亡蛋白的表達，使藥物介導的細胞凋亡作用明顯受抑制，引起乳腺癌細胞對順鉑的耐藥；而敲除乳腺癌細胞miR-203基因后，其對順鉑的敏感性顯著增加。而Kong等[34]的研究證實，miR-155通過調控轉錄因子FOX03a的表達使乳腺癌細胞對紫杉醇及多柔比星耐藥，而FOX03a的下游靶點均參與了細胞凋亡進程。Gong等[35]研究證實, miR-21表達上調使乳腺癌細胞對曲妥珠單抗治療耐藥，進一步研究證實其使同源性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog, PTEN)表達缺失，從而導致了腫瘤細胞的凋亡受抑制。以上研究均表明，在乳腺癌細胞中，miRNA可以通過調控細胞凋亡而介導乳腺癌細胞耐藥，這可能也是乳腺癌耐藥性形成的重要原因之一。

1.3 miRNA與藥物代謝酶

藥物代謝加快與乳腺癌患者對治療反應減弱關系密切[36]。細胞色素P450(CYP450)酶家族是催化藥物代謝反應的關鍵酶，超過80%的臨床常用藥物是經由CYP450代謝清除的。miRNA可以通過負調控藥物代謝酶CYP450家族中的CYP3A4、CYP1B1等成員的表達，進而調控乳腺癌的耐藥性。Tsuchiya等[37]在乳腺癌細胞MCF-7中證實miR-27b在轉錄后水平調節CYP1B1的表達，同時通過對24位乳腺癌患者癌組織及鄰近非癌組織的研究發現, miR-27b在乳腺癌組織中低表達，并伴隨CYP1B1蛋白的顯著高表達。另有研究證實, miR-27b[38]、miR-148a[39]抑制CYP3A4的表達。而CYP1B1[40]、CYP3A4[41]是乳腺癌對多西他賽耐藥的預測因子, CYP1B1、CYP3A4陽性乳腺癌對多西他賽的敏感性較陰性者顯著降低。而這些miRNA在乳腺癌耐藥細胞中均表達明顯降低，致CYP3A4、CYP1B1等表達增加，細胞內化療藥物迅速代謝，難以維持胞內有效濃度，進而引起細胞耐藥。

1.4 miRNA與乳腺癌干細胞

目前，乳腺癌干細胞(BCSC)的耐藥性已得到普遍的證實。而miRNA的異常表達能誘導BCSC的形成、有助于干細胞特性的維持，可能是BCSC耐藥性形成過程中的重要的調控因子。Shimono[42]和Iliopoulos[43]等研究均發現，miR-200家族在BCSC中表達水平顯著下降，而miR-200b的表達上調會阻斷BCSC的形成并干擾其特性的維持，從而顯著增強化療藥物對腫瘤生長的抑制作用; miR-200b在細胞內的表達水平下降則能顯著誘導BCSC的形成。miR-128[44]在耐藥性乳腺癌初始細胞中表達水平顯著下降，導致Bmi-1及ABCC5過表達，而顯示干細胞特性，并可抑制阿霉素介導的細胞凋亡和DNA損傷作用，產生耐藥；當上調BCSC中miR-128的表達水平時，能夠顯著逆轉BCSC對阿霉素的耐藥性。而Bmi-1過表達的細胞具有明顯的干細胞特性，并證明對順鉑及培美曲塞耐藥[45]。

2 miRNA在乳腺癌耐藥中的應用前景

2.1 miRNA與乳腺癌耐藥的預測

如果能夠利用miRNA的檢測進行乳腺癌的診斷及其耐藥性的分析，對于乳腺癌的臨床治療具有重要意義。Zhu等[46]發現，幾乎所有體液中均可以檢測到miR-16、miR-145和miR-155的表達。而Lodes等[47]更進一步證實，在1mL血漿中即可獲得足夠的可供檢測的miRNA，同時可用于判斷是正常組織還是腫瘤組織。這些充分說明外周血液中miRNA表達譜的檢測對乳腺癌的診斷及耐藥性的預測是有可能實現的。

2.2 miRNA與乳腺癌耐藥的治療

乳腺癌細胞耐藥性的形成與細胞內miRNA的異常表達密切相關，通過改變腫瘤細胞內相關miRNA的表達水平，逆轉乳腺癌的耐藥性是一種潛在的治療策略。誘導miRNA的再表達，多采用引入合成的短雙鏈RNA分子(即miRNA模擬物)的方式，在臨床前期動物實驗中，以病毒、脂質體及靶向納米顆粒為載體的轉染顯示了良好的作用及耐受性[48]。Kim等[49]將含有miR-145的腺病毒轉入人乳腺癌細胞株和乳腺癌小鼠模型體內，發現能有效抑制乳腺癌細胞生長，并且Ad-miR-145與5-Fu聯合使用療效明顯高于單獨使用時的療效。Bourguignon等[50]采用特異性的anti-miR-21序列沉默MCF-7細胞內過表達的miR-2l后，能有效阻斷HA-CD44介導的腫瘤細胞抗凋亡、耐藥等行為的形成。

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