熒光染色法在結核分枝桿菌檢測中的應用

張 立，周洪經，馮 爽

(天津市海河醫院，天津300350)

目前，臨床上對于結核病的診斷，臨床多使用X線、病理切片、痰涂片鏡下檢查、細菌培養等，但X線對無典型影像學表現患者有局限性;病理切片耗時長;厚涂片抗酸染色法結果較為準確，長期用于確診結核病，但鏡檢檢出時間較長，陽性檢出率較低，無法滿足臨床需要。在常見的幾種結核桿菌的檢測方法中，結核桿菌培養陽性率為25%～75%，PCR檢測結核桿菌DNA陽性率為77%～90%，但這兩種方法對實驗室要求較高，在基層醫院中難以開展［1，2］。我們采用熒光染料鹽基淡黃配制成熒光染液，采用熒光染色法對250例肺結核患者痰標本進行結核分枝桿菌檢測，并與抗酸染色法對比，發現熒光染色法可顯著提高陽性率。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 痰標本來自2012年10月～2013年6月天津市海河醫院住院和門診250例肺結核患者，這些患者均為初診患者，經X線、PPD試驗、結核抗體檢查等臨床初步診斷為活動性肺結核。每位患者收集深咯痰標本，每份痰標本涂抹2張玻片，分別進行抗酸染色(抗酸染色組)和熒光染色(熒光染色組)。

1.2 熒光染色劑、抗酸染液的配制方法 染色劑:取0.1 g鹽基淡黃溶于10 mL 95%乙醇中加3%石炭酸至100 mL。脫色劑:5%鹽酸乙醇。反襯劑:高錳酸鉀0.5 g，溶于100 mL蒸餾水。抗酸染液的配制按照“結核病診斷細菌學檢驗規則”進行。

1.3 痰涂片染色及觀察方法 用竹簽挑取標本的膿樣、血樣或干酪樣部分0.05～0.1 mL于玻片正面的右側2/3中央處，并均勻涂抹成1.0 cm×2.0 cm橢圓形痰膜，薄厚適中，室溫下自然干燥。將痰涂片進行染色和鏡檢。①染色方法:熒光染色組:將痰涂片用熒光染液染10 min，水洗后用5%的鹽酸乙醇脫色1～2 min至外觀無黃色為止，水洗后用反襯液染1～2 min，水洗晾干待檢。抗酸染色組:染色按“結核病診斷細菌學檢驗規程”進行。②鏡檢:熒光染色組:已染好的涂片用ZEISS Primo Star iLED熒光落射暗視野顯微鏡觀察，以10×目鏡、20×物鏡觀察痰涂片，40×物鏡檢查細菌細胞形態。抗酸染色組:染色好的痰涂片用OLYMPUS CX21普通光學顯微鏡100×物鏡觀察。熒光染色和抗酸染色鏡檢時間和結果報告標準均以“結核病診斷實驗室檢驗規程”為準。熒光染色結果報告:符合0條/50視野，則為熒光染色抗酸桿菌陰性(-);符合1～9條/50視野，則報告熒光染色抗酸桿菌數;符合10～99條/50視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(+);符合1～9條/視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(++);符合10～99條/視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(+++);符合≥100條/視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(++++)［3］。抗酸染色結果報告:連續觀察300個不同視野，符合0條/300視野，則為抗酸桿菌陰性(-);符合1～8條/300視野，則報告抗酸桿菌菌數;符合3～9條/100視野，則為抗酸桿菌陽性(+);符合1～9條/10視野，則為抗酸桿菌陽性(++);符合1～9條/視野，則為抗酸桿菌陽性(+++);符合≥10條/視野，則為抗酸桿菌陽性(++++)。

1.4 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件。計數資料比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

熒光染色組結核桿菌在黑暗背景下呈黃綠色，桿狀或短棒狀;抗酸染色組結核桿菌呈紅色桿狀，稍彎曲。

熒光染色組檢出結核分枝桿菌陽性109例，陽性率為 43.60%，其中(+)、(++)、(+++)、(++++)陽性率分別占13.20%、11.60%、8.40%、10.40%;抗酸染色組陽性86例，陽性率為34.40%，其中(+)、(++)、(+++)、(++++)分別占6.80%、8.80%、8.00%、10.80%。兩組總陽性率及(+)陽性率比較P均＜0.01。250例活動性肺結核患者痰標本，熒光染色法檢測出109例陽性標本中抗酸染色檢測79例為陽性、30例為陰性;熒光染色檢測為陰性的141例標本中抗酸染色檢測134例為陰性、7例為陽性;而在抗酸染色為陽性的86例標本中，其中熒光染色檢測79例為陽性、7例為陰性。熒光染色組的靈敏度為91.86%、特異性為95.04%;抗酸染色組的靈敏度為72.48%、特異性為81.71%。與抗酸染色組比較，熒光染色組檢測痰中結核桿菌的靈敏度、特異性均較高(P均＜0.05)。

3 討論

熒光染色可用于結核患者的抗酸桿菌檢驗工作，如結核桿菌或麻風桿菌，操作簡便，觀察結果更為迅速，陽性率較抗酸染色法高［4，5］，也有文獻［6］報道熒光染色法檢測痰中結核桿菌的靈敏度高，特異性與準確率也較高。為了進一步驗證其結果的可靠性，我們采用熒光染色和抗酸染色兩種方法對250例痰標本中的結核分枝桿菌進行檢測。從結果可以看出經痰結核菌涂片的熒光染色陽性率高于抗酸染色，這與國內的其他報道［7，8］相符合。熒光染色組抗酸桿菌(+)的陽性率高于抗酸染色組，而(++)、(+++)、(++++)的陽性率兩組間差異無統計學意義。這表明熒光染色和抗酸染色陽性率差異主要體現在(+)陽性率上，即含菌量較少的標本。這對于那些病變活動輕微，排菌量較少的肺結核病的診斷具有重要意義。熒光染色和抗酸染色的原理相同，都利用了結核桿菌的嗜石炭酸性，在染色劑中加入了石炭酸作為媒染劑，熒光染色的陽性率高于抗酸染色，原因是某些長期服用藥物的患者結核桿菌的抗酸性被破壞，但熒光染色性仍保留，結果在抗酸染色中為陰性，而在熒光染色中呈陽性。通過熒光染色可明顯提高陽性檢出率，有利于臨床診斷。文獻報道，熒光染色法的特異性為93.8%，假陽性率為7%［9，10］，均優于抗酸染色。另外，由于熒光染色僅需要在40×的高倍鏡下觀察，視野大，對陰性結果的判讀僅需選取50個視野內未發現桿菌即可，顯著加快了鏡下檢查的速度和判讀，結果報告變得簡單、快捷［11］，能夠滿足臨床大量標本初篩及迅速出結果以供臨床早期對癥治療的要求。

熒光染色鏡檢中需要注意的問題:①鹽基淡黃熒光染液應新配制避光保存，使用時間不宜超過1周，以免熒光減退。染色時嚴禁缸染，應單獨進行染色，以防交叉污染，造成假陽性。②脫色時間不宜超過2 min，脫色時間過長背景過暗，影響鏡檢結果，脫色時間過短熒光染料脫色不完全，容易造成假陽性。③熒光染色后涂片應24 h內鏡檢完畢，否則熒光減退，影響陽性檢出率。④熒光染色鏡檢時應認真觀察抗酸桿菌的形態，應具備抗酸染色工作經驗后方可進行。對于用20×物鏡50個視野內發現1～9條抗酸桿菌者，應以抗酸染色復染該片或另取一張抗酸染色的同一標本復驗。⑤熒光染色鏡檢抗酸桿菌在暗色背景下會發出黃綠熒光，非常醒目容易發現，而且40×物鏡視野大，鏡檢速度快(通常2 min左右)，而抗酸染色100×油鏡檢視野小，鏡檢較慢(通常要4～6 min)。因此熒光染色很適合用于工作量大的單位，可提高工作效率。

可見，熒光染色法檢測結核分枝桿菌的陽性率高于抗酸染色法，尤其是在檢測排菌量少的患者中;同時熒光染色法是一種檢查靈敏度高、較為方便快捷的方法，可在結核患者的早期診斷治療中予以推廣和應用。

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