代謝組學在轉基因作物非預期效應評價中的應用

王 森，李健爽，杜曉燕

代謝組學在轉基因作物非預期效應評價中的應用

王 森，李健爽，杜曉燕*

（哈爾濱醫科大學公共衛生學院，黑龍江 哈爾濱 150081）

外源基因的非預期效應可能形成新的代謝產物或改變代謝模式，也可能引起轉基因作物的營養成分發生改變，甚至可能會產生一些新的有毒物質，是轉基因食品安全性評價的重要內容之一。本文主要對近年來代謝組學技術在轉基因作物非預期效應評價中的最新應用做了總結，并闡述了對該研究領域的預期，以期促進轉基因食品安全性評價體系的發展和完善。

轉基因作物；代謝組學；非預期效應；評價

近年來，由于轉基因作物的商業化和大面積種植，有關其非預期效應和生態安全的研究成為熱點問題。在已頒布的管理法規、安全性評價原則及技術方案中，非預期效應的篩查和評價都被列為重要內容。非預期效應是指外源基因的轉入導致農業轉基因生物的表型性狀和遺傳性狀在傳代、生長、發育和代謝等過程中發生偏離基因工程設計目標的變異或抗生素抗性基因發生水平轉移[1]。由于外源基因的非預期效應具有潛在性、非預見性，因此以實質等同性為基礎的定向方法很難充分考慮到由基因修飾所引起的非預期效應。“實質等同性”這一概念是由世界經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）最早提出，其本質是比較原則，即將轉基因食品與傳統食品從表形性狀、農學性狀、組成成分等方面進行比較，從而得出轉基因食品是否與傳統食品具有實質等同性的結論，它是目前普遍公認的評價轉基因食品安全性的有效途徑。組學技術是近年發展起來的一門新興技術，它的應用大大增加了篩查非預期效應的機會[2]。利用代謝組學技術從代謝水平上比較轉基因作物與非轉基因作物的代謝差異，是篩查轉基因作物非預期效應的一個頗具前途的重要技術手段。

1 轉基因作物非預期效應的來源

1.1 目標性狀變異

目標性狀包括與外源基因功能相關的表形性狀和遺傳性狀。轉基因作物任何目標性狀變異直接或間接的與轉錄的變化、外源基因的表達及其調控功能有關。目標遺傳性狀變異是目標表型性狀變異的一個內在因素。研究結果表明，轉化效應、位置效應、重組效應和修飾效應都能導致轉基因作物的目標遺傳性狀發生變異[3]。

1.2 非目標性狀變異

非目標性狀包括轉基因生物的表型性狀和遺傳性狀，轉入基因的功能忽略不計，但是轉入基因對受體內源基因的結構、轉錄、表達和調控功能的影響都可導致非目標性狀發生變異。根據相關文獻，非目標遺傳性狀變異與插入效應、誘導效應和異源效應有關[3]。這些效應可能導致非目標遺傳性狀變異，并且進一步引起表型性狀變異。

1.3 基因水平轉移

細胞間DNA水平轉移的機制非常復雜，它受很多因素的限制。其中一個關鍵機制是DNA在細胞間轉移，通過接合、轉導或轉化，DNA可以在同一物種以及不同物種的細胞間水平轉移。另一個關鍵機制是外源基因的整合，DNA可以通過DNA重組插入到受體基因組中，包括同源重組、換位、位點特異性重組和DNA修復。基于這兩個機制，在轉基因作物中DNA可以水平轉移到其他生物細胞內[3-4]。

2 轉基因作物非預期效應的篩查方法

目前，轉基因作物非預期效應的篩查方法主要包括定向方法和非定向方法。

2.1 定向方法

針對特定目標的檢測方法稱為定向方法。該方法主要是對一些重要營養素和關鍵毒物進行單成分分析，通過比較分析來確定轉基因品種和親本品種之間的是否存在差異，該方法已成功應用于第一代轉基因作物的安全評價，并被國際組織廣泛接受。然而，定向方法已被普遍認為存在以下兩方面的局限性[5]：一是至今仍沒有普遍公認的、統一的指導方針來確定分析的完整程度；二是定向方法僅關注已知化合物和可預見的變化，結果可能存在偏倚。

2.2 非定向方法

由于定向方法的局限性，研究者們開始關注非定向方法。以組學技術為基礎的非定向方法已經逐步形成而且備受關注。組學技術包括轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學[6]。轉錄組學技術主要是研究轉基因作物的基因表達變化，檢測基因表達譜的差異性，作為基因修飾的非預期副作用的一個指證，以便為進一步研究毒理學的相關性提供信息[5]。但是轉錄組的變化并不一定會導致蛋白質組和代謝組也發生變化，因此不一定能預測到食品成分和質量的變化[7]，轉錄組學在非預期效應評價中受到限制。蛋白質組學研究可以為理解基因修飾后生物過程的變化提供重要的信息[8]。因為蛋白質是基因轉錄和翻譯的直接產物，蛋白質組學非常適合檢測轉基因作物在基因組、基因調控、或生化途徑中的變化[9]。但是蛋白質組學分析不夠快速，定量不典型，比較昂貴，并且需要專門的設備和軟件[7]。因此，降低了其在安全評價中的應用優勢。與其他組學相比代謝組學更能反應生物體的整體信息，并且基因表達和蛋白質變化對系統產生的影響都能在代謝水平上得到體現[10]。通過對轉基因作物代謝譜或生物標志物的研究，可以從代謝水平了解轉基因作物可能產生的異常生理狀態，提高篩查效率。代謝組學技術有潛力成為篩查非預期效應最有力的技術手段。

此外，轉基因生物的目標性狀變異還存在另一種特殊形式，即轉基因生物基因組中整合的表達抗生素抗性產物的外源基因發生向其他非靶生物細胞的轉移而導致非靶生物細胞產生相應的耐藥性。這種變異形式稱為抗生素抗性基因的水平轉移[11]。對轉基因作物的抗生素抗性基因的水平轉移的篩查方法一般是基于體內和體外檢測模型[12]。轉基因作物的抗生素抗性基因可以向環境中或是動物胃腸道內的細菌轉移，根據模型，可以通過這兩個途徑檢測抗生素抗性基因的水平轉移。

3 代謝組學在轉基因作物非預期效應評價中的應用

常用的代謝組學分析技術主要有核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術和色譜-質譜聯用技術。

3.1 核磁共振技術

NMR技術是最早應用于代謝組學研究的手段之一，其優勢在于能夠對樣品實現無創性、無偏向的檢測，且無需對樣品進行預處理，易于鑒定化合物的結構信息。它的缺點是檢測靈敏度較低并且動態范圍有限，難以同時對同一樣品中濃度相差很大的物質進行檢測[13]。

Piccioni等[14]采用一維和二維NMR技術對轉Cry1A（b）基因玉米種子及其對應的傳統玉米種子的代謝譜進行了分析。轉基因樣品與非轉基因樣品相比，除了乙醇、檸檬酸、甜菜堿、海藻糖，以及尚未完全確定的另一種化合物濃度升高外，轉基因品種中沒有出現新物質。Picone等[15]也采用NMR技術評估了轉基因葡萄，發現基因修飾導致轉基因葡萄與其對應的野生品種在代謝水平上發生了不同程度的變化。此外，Kim等[16]采用傅里葉變換紅外光譜（fourier transformed infrared spectroscopy，FT-IR）和1H-NMR光譜結合多變量分析對轉基因馬鈴薯塊莖和野生型馬鈴薯塊莖做了比較分析，轉基因馬鈴薯和野生型馬鈴薯之間沒有出現代謝差異，但是新鮮馬鈴薯和貯藏1周之后的馬鈴薯差異比較明顯。

在以往的研究中，都是以體外評價模型為基礎，采用代謝組學方法分析轉基因作物的代謝物是否發生了非預期的代謝差異，Cao Sishuo等[17]通過代謝組學技術建立了一個新的體內評價模型來評價轉基因作物的安全性。在這項研究中，分別飼喂大鼠轉基因水稻和非轉基因水稻90 d，收集0、30、60、90 d 4 個時間點的24 h尿液，用1H-NMR檢測大鼠尿液代謝物的變化，以考察與非轉基因水稻相比較轉基因水稻是否誘導了大鼠尿液的代謝物發生變化，并采用多變量分析和方差分析分別來確定差異和差異的顯著性。多變量分析結果表明，在轉基因組與非轉基因組之間，與零時間點比較，3個時間點大鼠尿液中的α-酮戊二酸和馬尿酸有不同的變化趨勢，而且在所有3個時間點中轉基因組大鼠尿液的乙酸量都高于非轉基因組。然而，方差分析的結果表明，在第1個月轉基因組大鼠尿液中的α-酮戊二酸，馬尿酸和乙酸與非轉基因組有顯著差異，但是在第2個月和第3個月，轉基因組與非轉基因組比較大鼠尿液中的這些代謝物沒有差異。鑒于這些變化的不穩定性和不連續性，不能認為這些變化與轉基因水稻有關。最終得出結論，這些差異并不具有生物學意義。這是首次采用NMR技術對轉基因產品90 d喂養大鼠尿液進行代謝物分析，該方法是對傳統轉基因作物安全評價方法的補充。作為一種非侵入性、動態監測方法，代謝組學將會為轉基因作物及其食品的安全性評價開辟新的道路。

3.2 色譜-質譜聯用技術

利用色譜的分離作用和質譜的鑒定作用能夠對代謝物進行準確定量和快速定性分析，色譜-質譜聯用技術在代謝組學研究中顯示出了巨大的發展潛力，常用的色質聯用技術主要有以下幾種。

3.2.1 氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）

由于GC-MS具有較高的分離效率和靈敏度，易于操作且較為經濟，被廣泛應用于代謝組學分析。但是GC-MS僅限于分析揮發性的物質，無法分析熱不穩定性和分子質量較大的代謝產物[13,18]。

為了研究轉兩種抗蟲基因（cryIAc和sck）水稻在代謝水平上是否導致了非預期效應，Zhou Jia等[19]采用氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）和GC-MS相結合的方法尋找轉基因水稻與非轉基因水稻之間的代謝變化。為了確定環境因素對代謝物的影響，還檢測了不同播種日期或地點的野生型樣品。對谷物中的極性化合物進行提取和三甲基硅烷化后，再用GC-FID進行分析。利用偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）來區分轉基因水稻和野生型水稻，挑選出有顯著性差異的代謝物，然后通過GC-MS進行鑒定。研究結果發現，環境因素對水稻某些代謝物誘導了相似的影響，如轉基因和非轉基因樣品中3-磷酸甘油、檸檬酸、油酸、蔗糖等的含量都有較大幅度增加。而與非轉基因水稻比較，轉基因水稻中的蔗糖、甘露醇和谷氨酸含量增加較顯著，提示這幾種代謝物的差異可能與基因修飾相關。他們的研究區分了環境因素與基因修飾所導致的代謝物差異，對評價轉基因作物的非預期效應有著重要意義。當然，要獲得更多關于轉基因水稻安全評價的信息，還有很多工作有待完成。另外，Frank等[20]采用GC-MS調查了轉Bt基因玉米及其對應的非轉基因品種的代謝差異，發現觀察到的大部分差異都與環境因素導致的自然變異有關，與基因修飾關系不大。由于非預期效應不但會出現在轉基因作物中，也會出現在傳統農作物的育種和生長過程中，轉基因產品非預期效應的篩查更加困難。代謝組學技術在鑒別基因修飾和環境因素導致的非預期效應方面表現出了極大的潛力。

Kim等[21-22]應用氣相色譜-飛行時間質譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）對增強轉基因作物的營養價值所導致的非預期變化進行了評估。該方法準確、靈敏，而且非常快速。他們采用GC-TOF-MS檢測了β-胡蘿卜素生物強化水稻的14種親脂性化合物[21]；又采用同樣的方法分析了類胡蘿素生物強化水稻和5種傳統水稻品種的52種極性代謝物，均未出現非預期的不良變化[22]。

3.2.2 液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）

LC-MS也是一種在轉基因作物代謝組學研究中常用的手段。LC-MS不需要對樣品進行衍生化預處理，并且具有較高的靈敏度和較寬的動態范圍，可重復定量分析，適用于分離和分析那些極端復雜的樣品[13,23]。目前，LC-MS技術已發展成為代謝組學研究的主流技術手段。

Chang Yuwei等[24]采用快速高分離液相色譜-四極桿飛行時間質譜（rapid resolution liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry，RRLC-TOF-MS）分析了水稻種子。研究發現該方法的線性、重現性、日內精密度和日間精密度都非常好。故采用該方法研究轉基因水稻及其親本作物在代謝水平上的差異。此外，還比較了不同播種時間和不同播種地點的水稻以評價環境因素可能產生的效應。多元數據分析發現不同播種地點的水稻存在代謝差異，并找到了對環境變化比較敏感的物質甲煙酸內鹽。結果表明對于多數代謝產物，如色氨酸、9,10,13-三羥基十八碳-11-烯酸、溶血磷脂酰乙醇胺（16∶0），環境因素比基因修飾起到了更大的作用。而對于植物鞘氨醇、棕櫚酸及其他3個未鑒定的代謝物，其含量的輕微變化更傾向于與基因修飾相關。其研究通過比較環境因素和基因修飾誘導的變化，表明由基因修飾引起的代謝物變化是否包含在環境因素導致的變化范圍之內。

García López等[25]采用反相高效液相色譜-電噴霧質譜法（reversed-phase high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry，RPHPLC-ESI-MS）對轉基因玉米和非轉基因玉米進行了代謝組學分析。該方法具有靈敏度高，檢測范圍寬等優點，這是第一次采用RP-HPLC-ESI-MS來分析玉米品種，結果發現被測樣本之間存在一些相似性和差異性。Kim等[26]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（highperformance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD）和HPLC-MS研究轉基因中國白菜和非轉基因中國白菜的代謝指紋譜，沒有找到可以區分轉基因中國白菜與非轉基因中國白菜的差異代謝物。

3.2.3 毛細管電泳-質譜聯用（capillary electrophoresismass spectrometry，CE-MS）

與其他類型聯用技術相比，CE-MS具有更高的分離速度和效率，且樣品和試劑消耗量少，分析速度快，近年來在代謝組學的研究中越來越受到重視[18,27]。

L e v a n d i等[28]采用毛細管電泳-飛行時間質譜（capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry，CE-TOF-MS）來識別和定量3種轉基因玉米及其對應的非轉基因品種的主要代謝物。為了從玉米面中提取出數量最多的代謝物，提取過程中對超聲條件和溶劑選擇進行了優化。由于在線電噴霧-TOF-MS質量精度非常好，識別代謝物精準，故采用該手段識別代謝物。引入分子式到不同的數據庫中后，初步鑒定出27種代謝物。數據分析發現轉基因玉米與其對應的非轉基因品種相比，有一些代謝物有顯著性差異，如L-肉堿和水蘇堿，這些差異代謝物可能是轉基因玉米的生物標志物。在一個類似的研究中，García-Villalba等[29]采用同樣的方法對轉基因大豆和非轉基因大豆的代謝譜進行了比較分析，該方法初步鑒定出40多種代謝物。結果表明所檢測到的代謝物中有一些沒有發生變化，而另一些在轉基因大豆與傳統品種中表現出了顯著性差異。

3.2.4 多平臺方法

多種代謝組學技術平臺相結合的方法在代謝組學領域的應用越來越受到青睞。這種多平臺方法可以對代謝組進行全面檢測，并可為人們理解生物系統中差異代謝譜的意義提供有價值的信息。

Leon等[30]采用CE-TOF-MS和傅里葉變換離子回旋共振質譜法（Fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry，FT-ICR-MS）結合的方法研究了3種轉基因玉米及其對應的野生型品種的代謝差異。上機之前采用加壓溶劑萃取（pressurized liquid extraction，PLE）對被測物品進行提取和分離。由于FT-ICR-MS不能區分不同異構體之間的結構，所以采用CE-TOF-MS對化合物進行識別，兩者的結合大大提高了篩選新的生物標志物的效率，并且FT-ICR-MS的超高分辨率和靈敏度剛好彌補了CE-TOF-MS重復性較差且靈敏度很低的缺點。結果發現與野生型品種比較轉基因品種的某些代謝途徑被改變，存在代謝差異。這是首次報道采用CE-TOF-MS，FT-ICR-MS和PLE三者結合的方法研究轉基因作物。為了研究轉基因番木瓜的潛在非預期成分變化，Jiao Zhe等[31]采用HPLC，GC-MS和LC-MS對轉基因番木瓜和非轉基因番木瓜的一些特定成分進行了分析，發現二者的這些特定成分含量相似，但是不同時期收獲的木瓜表現出更高程度的成分變化。此外，Jiao Zhe等[32]還采用近紅外光譜法（near-infrared reflectance，NIR）、GC-MS、HPLC和電感耦合等離子體發射光譜（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES）并結合化學計量學方法對3種抗逆轉基因水稻進行了代謝組學研究，發現轉基因水稻發生了一些非預期的成分變化，營養物質如蛋白質、3種氨基酸、兩種脂肪酸、兩種維生素以及幾個元素都發生了不同程度的變化，而抗營養因子肌醇六磷酸沒有顯著改變。Kusano等[33]也采用多平臺方法評估了轉基因番茄。為了減少化學偏倚，研究者通過GC-MS、LC-MS和CE-MS等多種儀器采集數據，沒有發現非預期的代謝變化。

4 結 語

代謝組學作為一種高通量、高靈敏度、高精確度的現代分析技術，近年來被廣泛應用于轉基因作物的非預期評價中，它可以為轉基因食品的安全性評價提供有力的科學依據。但是，代謝組學仍面臨著許多挑戰和亟待解決的關鍵問題。首先，在實驗設計與分析方面沒有一致性，很多已經發表的關于觀察到轉基因作物與傳統作物存在差異性的研究都缺少生物驗證，甚至沒有生物重復實驗。因此，迫切需要建立一個標準來規范和報告實驗設計與分析的細節[34-35]。其次，代謝組學的終極目標是檢測鑒定機體內的所有代謝產物，但目前所廣泛采用的儀器設備幾乎做不到這一點，即使能檢測到，往往也鑒定不了化學結構。面臨這些瓶頸問題，開發靈敏度高、檢測范圍廣的檢測技術，建立并擴展代謝產物鑒定數據庫是代謝組學在未來的主要發展方向[36]。此外，任何一種組學技術平臺的單獨使用提供的信息都是有限的，不同組學技術間的數據整合將會提供更多的信息，如何整合不同組學技術平臺和不同組學技術的數據將會是一個重要挑戰[37]。在以后的研究中，將需要更靈敏的技術以檢測更大范圍的非預期效應。定向方法與非定向方法的結合可能會是評價轉基因作物生物安全性的更好的方法。

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Applications of Metabolomics in Evaluation of Unintended Effects of Genetically Modified Crops

WANG Sen, LI Jian-shuang, DU Xiao-yan*
(College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081, China)

Unintended effects from exogenous gene may form new metabolites or change metabolic patterns and nutrients of genetically modified crops, and even generate some new toxic substances. The study on unintended effects is one of the important contents of safety evaluation of genetically modified foods. This review focuses on the latest applications of metabolomics in evaluation of unintended effects of genetically modified crops, and describes research expectations in this field, so as to promote the development and improvement of safety evaluation system for genetically modified foods.

genetically modified crops; metabolomics/metabonomics; unintended effects; evaluation

TS201.6

A

1002-6630（2014）09-0312-05

10.7506/spkx1002-6630-201409061

2013-05-17

農業部轉基因生物新品種培育國家重大科技專項（2011ZX08011-005）

王森（1984—），女，碩士研究生，研究方向為食品檢驗技術及代謝組學。E-mail：644326653@163.com

*通信作者：杜曉燕（1954—），女，教授，學士，研究方向為生物傳感器及生物、食品檢驗技術。E-mail：duxiaoyanha@163.com