阪崎克羅諾腸桿菌 致病性機理 研究進展

劉 咪，楊保偉，夏效東，王 新，席美麗

阪崎克羅諾腸桿菌 致病性機理 研究進展

劉 咪，楊保偉*，夏效東，王 新，席美麗

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾腸桿菌是一種革蘭氏陰性無芽孢腸道桿菌，可導致新生兒和免疫功能不全的嬰幼兒嚴重腦膜炎、菌血癥和壞死性結腸炎，是一種非常重要的食源性條件致病菌。目前，國內外對阪崎克羅諾腸桿菌的致病性及其致病機理的研究報道非常有限。本文通過阪崎克羅諾腸桿菌外膜蛋白A、脂多糖、生物膜、宿主細胞骨架、鐵獲得機制、海 藻糖的存在、超廣譜 β-內酰胺酶的產生和細胞間相互作用等方面對阪崎克羅諾腸桿菌的致病性機理進行綜述。

阪崎克羅諾腸桿菌；致病性；機理；進展

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種常見的寄生于人和動物腸道內的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，有周生鞭毛、能運動、兼性厭氧，為腸道正常菌群菌之一[1]。阪崎克羅諾腸桿菌最初被認為是腸桿菌科腸桿菌屬中陰溝腸桿菌的生物變型菌，并被命名為黃色陰溝腸桿菌（yellow pigmented Enterobactor cloacae），ATCC29544被認定為此變形種的模式菌株。直到1980年，Farmer等[2]將其收集的57株阪崎克羅諾腸桿菌進行了DNA雜交、生化反應、黃色菌落產物及抗生素敏感性等一系列實驗，結果發現黃色陰溝桿菌與檸檬酸桿菌屬和腸桿菌屬中的細菌有41%～50%的相關性，但其表型和DNA相似性與腸桿菌屬中的陰溝腸桿菌更加接近（50%），因此將其分類劃歸于腸桿菌屬[3]。目前，克羅諾菌屬作為一種新屬，包括5個種（Cronobacter sakazakii、Cronobacter malonaticus、Cronobacter dublinensis、Cronobacter muyyjensii和 Cronobacter turicensis），和一個阪崎克羅諾腸桿菌基因種1（Cronobacter genomospecies group 1）[4-5]。隨著新一代DNA測序技術的發展，功能基因組學方法已應用于阪崎克羅諾腸桿菌致病機制及進化研究。至今已有3個阪崎克羅諾腸桿菌完成全基因測序（Cronobacter sakazakii ATCC BAA-894、ES15和SP291)[6-9]，另有4個阪崎克羅諾腸桿菌基因組完成拼接[7]。其中，BAA-894菌株的染色體大小為4.4 Mb，兩個質粒分別為31 kb的pESA2和131 kb的pESA3[6]。pESA2攜帶許多在其他阪崎克羅諾腸桿菌沒有的新基因，其編碼的一個四型分泌系統可能介導該質粒的接合轉移[10]。

1 阪崎克羅諾腸桿菌的致病性

阪崎克羅諾腸桿菌作為一種條件致病菌，能導致嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，是近幾年來受到廣泛關注的一種非常重要的食源性致病菌。1歲以下嬰兒、出生體質量偏低和未滿28 d的新生兒被認為是阪崎克羅諾腸桿菌最容易感染的人群，其死亡率高達50%。免疫力低下的成年人食用阪崎克羅諾腸桿菌污染的食物也能導致疾病[11]。盡管在阪崎克羅諾腸桿菌感染的臨床治療中使用抗生素可以使患者康復，但患者往往伴隨有嚴重的神經系統后遺癥和發育障礙等癥狀[12]。雖然目前已經從很多食品樣本（包括肉類、奶酪、蔬菜、谷物、草藥、香料和超高溫瞬時殺菌牛奶等）和環境樣本（工廠和家庭），甚至昆蟲中檢出該菌，但在很多情況下，嬰幼兒配方粉（powdered infant formula，PIF）被認為是阪崎克羅諾腸桿菌主要的污染來源和傳播介質，相關研究也表明只有嬰兒配方粉與嬰幼兒腦膜炎的爆發相聯系[5,13-14]。

人被阪崎克羅諾腸桿菌感染后會出現各種病癥，初期表現為發熱、精神萎靡和嗜睡。阪崎克羅諾腸桿菌侵入腦微血管上皮細胞后，會引起血腦屏障，并存在于腦巨噬細胞中影響細胞因子的分泌，導致嚴重的大腦疾病[15-16]。阪崎克羅諾腸桿菌引起的新生兒腦膜炎常引起腦梗塞、腦膿腫和囊中形成等并發癥，可能導致新生兒迅速死亡，幸存者也可能會患有嚴重的后遺癥如腦積水、四肢癱瘓、智力發育不全導致的永久性精神和物質功能傷害。阪崎克羅諾腸桿菌感染還經常伴隨壞死性小腸結腸炎（necrotizing Enterocolitis，NEC），以小腸壞死和小腸壁積氣為特征，是新生兒中最常見的胃腸病發生事件，在早產兒中有2%～5%的發生率，并且在出生時有13%的新生兒體質量低于1.5 kg。壞死性結腸炎與腸道局部缺血、腸道微生物生長和腸腔中與配方食品有關系的過量蛋白質基質的存在具有很大的關系[12,17]。

研究表明，將阪崎克羅諾腸桿菌經酪蛋白氨基酸酵母浸膏培養液培養后侵襲乳鼠，灌胃飼養后將乳鼠處死，無菌解剖，取腸、肝和腎等組織器官，制做切片，HE染色后顯微鏡下觀察其組織器官，可發現乳鼠腸、肝、腎均發生明顯病變。這些病變主要包括結腸和直腸黏膜血管擴張充血、皺襞變短、上皮細胞變性或水腫、核變圓或消失、平滑肌細胞核濃縮、排列緊密，肝組織出現彌漫性點狀壞死和局部脂肪變性，腎組織中腎小管變性、腎小球體細胞增生、腎小管上皮細胞變性、數量減少、靜曲管上皮細胞變性、并伴有細胞崩解和間接水腫[1]。由此表明，阪崎克羅諾腸桿菌能夠引起肌體器官的損傷，對肌體具有潛在危害，由它引起的食源性安全問題不容忽視。

2 致病機理

對致病菌毒力因 子的研究是揭示毒力因子與宿主的相互作用及其致病機理的關鍵。目前，對阪崎克羅諾腸桿菌的致病性機理研究還不太深入和全面。阪崎克羅諾腸桿菌不同菌種和不同菌株間均具有不同的毒力特性，也具有不同的定殖、黏附和侵入能力[14,18]。Cruz等[4]研究表明，從人體和非人體中分離的43株阪崎克羅諾腸桿菌中，86%的分離株可以黏附HEp-2細胞，35%具有侵入性，26%可以形成生物膜，充分體現了阪崎克羅諾腸桿菌的毒力多樣性。為更好了解阪崎克羅諾腸桿菌的致病性，本文將從外膜蛋白A、脂多糖和宿主細胞骨架等方面闡述阪崎克羅諾腸桿菌的致病機理。

2.1 外膜蛋白A（outer membrane prot ein，OmpA）

OmpA是革蘭氏陰性細菌中最主要的毒力因子之一。OmpA有很多功能，是阪崎克羅諾腸桿菌噬菌體的結合位點，也是F-菌毛介導的接合反應的中間體。OmpA的存在既可維持外膜蛋白和正常細胞形 態結構的完整性，也可以在外菌膜中形成 小的非特異性擴散通道。當阪崎克羅諾腸桿菌侵入宿主細胞后，OmpA可以激發宿主產生應激防御反應，但OmpA的存在卻可以幫助阪崎克羅諾腸桿菌抵御宿主細胞中抗血清和中性粒細胞的抗菌活性[19]。

研究表明，OmpA對阪崎克羅諾腸桿菌向人腦微血管內皮細胞滲透至關重要，該蛋白的表達對腦膜炎的發生有著非常重要的意義[15,19-20]。通過配位體免疫印跡分析，OmpA被認為是阪崎克羅諾腸桿菌中最重要的纖連結合蛋白。OmpA可以結合纖連蛋白，促使其侵入腦上皮細胞。小鼠模型研究表明該蛋白的表達會影響新生小鼠腦膜炎的發生， 在100%致死率的小鼠模型中均檢測到了OmpA，未檢測到OmpA的感染小鼠中未發現任何臨床致病表現[20]。此外，OmpA對血清凋亡具有抗性，表達OmpA的細菌可以成功穿越小腸屏障以及腦和血液中多種屏障，并且會在感染動物體內導致腸細胞的凋亡[20]。相反，不表達OmpA的突變株則不能有效的結合腸上皮細胞，侵入能力降低，也不能造成腸細胞的凋亡，而且，對凋亡血清非常敏感[3-4,20]。

2.2 脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）

LPS是革蘭氏陰性細菌細胞外壁中非常重要的結構和功能分子，也是一種非常重要的毒力因子。LPS的脂酰鏈嵌入到細菌的外膜，糖鏈則暴露于細菌的表面，并具有抗原性，也稱作內毒素。革蘭氏陰性細菌細胞裂解時釋出，無特異性的致病作用，具有一定的耐熱性。

2007年，Townsend等[21]發現嬰兒配方奶粉中含有細菌脂多糖——LPS，該LPS具有熱穩定性，能增加小腸上皮細胞通透性，促使細菌侵入宿主腸壁而致病。該研究小組將純化的腸桿菌LPS與阪崎克羅諾腸桿菌一起注射到乳鼠腹腔后，能明顯提高阪崎克羅諾腸桿菌穿透血腦屏障的能力，該研究雖未證明阪崎克羅諾腸桿菌產生LPS，但推測阪崎克羅諾腸桿菌的致病性與細菌LPS有明顯的關聯[12,15]。近年來，多項研究發現阪崎克羅諾腸桿菌細胞內可以合成兩種脂多糖，而且已經闡明其LPS的結構及其合成途徑相關基因[22-24]。

2.3 生物膜的產生

生物膜（biofilm）是微生物細胞與外界環境相互作用的接口，通常鑲嵌在一種內源性的黏稠基質中，被稱 為胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）[25]。微生物EPS的產生可以增加細胞對外界環境壓力的抵抗力，由于細菌所處的環境及表面介質不同，不同菌株形成生物膜的能力和生物膜的種類也存在差異。阪崎克羅諾腸桿菌EPS的產生增加了該菌在不同環境下的存活能力[13]。

研究表明，只要存在一定的營養條件和適宜的溫度，部分阪崎克羅諾腸桿菌菌株就可以在不銹鋼管、玻璃管、PVC塑料管腔內壁和硅膠等介質中吸附生存，并形成生物保護膜，抵御消毒劑等的殺傷作用[12,25]。目前，阪崎克羅諾腸桿菌生物膜的形 成增加了它對消毒液的抗性已被相關研究證實[26]。與此同時，脂多糖的裂解可以導致阪崎克羅諾腸桿菌外膜變化，增加其形成生物膜的能力[24]。鞭毛的存在對阪崎克羅諾腸桿菌的黏附也起著很重要的作用[12,26]。

2.4 宿主細胞骨架

宿主細胞骨架是一個排列成絲狀的動態蛋白網絡，這種附屬蛋白在細胞形狀、與運動相關的細胞器官、染色體運動和吞噬作用等細胞功能中起著關鍵性作用[20]。很多細菌病原體利用細胞骨架的多功能性來調節它們與宿主之間的相互作用，如上皮細胞的侵入[17]。破壞細胞的緊密聯系可以提高致病菌的入侵效率[27]。

細菌侵襲并穿越血腦屏障（blood-brain barrier）是細菌性腦膜炎發生的關鍵環節[28]。血腦屏障由腦微血管內皮細胞及細胞間的緊密連接、血管基膜和星形膠質細胞的足突構成[29]。目前，體外培養的人腦微血管內皮細胞常被用作血腦屏障的體外模型用以研究細菌侵襲血腦屏障的機制。微絲和微管是真核細胞細胞骨架的主要組分，微絲和微管的動態組裝過程在維持細胞形態和協助細胞發揮生理功能方面起著重要的作用。研究表明，阪崎克羅諾腸桿菌侵襲人腦微血管內皮細胞后，細胞骨架結構發生明顯的改變，微絲和微管部分斷裂、模糊、散在分布，并且發生重新組裝，這些結果均表明微管和微絲都參與了阪崎克羅諾腸桿菌侵襲進入人腦微血管內皮細胞[30-31]。

2.5 鐵獲得機制

鐵是細菌最基本的微量元素之一，它作為一些重要酶的輔因子參與細胞的基本新陳代謝，包括電子轉移、細胞呼吸和超氧化物代謝等[32-33]。同時，鐵也是細菌致病機理的重要因素之一[34-35]， 在缺鐵的生存環境中，細菌產生一種高親和的鐵結合分子（如：鐵載體）來吸收環境中的鐵，形成鐵載體復合物。這種鐵載體復合物通過特殊的鐵吸 收系統進入細菌胞內，因此，鐵獲得能力經常被認為是致病菌進入宿主肌體產生感染作用的先決 條件[32-33]。

Franco等[5]在對阪崎克羅諾桿菌Cronobacter sakazakii BAA-894和蘇黎世克羅諾桿菌C. turicensis z3032等的全基因測序中發現，它們各自都含有相類似大小的質粒pESA3（131 kb）和pCTU1（138 kb），且這些質粒的存在均和含鐵細胞的活動有關。pESA3含有cpa基因和T6SS基因，pCTU1含有編碼絲狀血凝素的基因和特殊的與毒力黏附相關的轉運基因，表明它們是與毒力有關的質粒[5]。生物信息學分析表明，pESA3和pCTU1質粒都含有一個類似RepFIB的基因repA和兩個鐵獲得系統（eitCBAD和iucABCD/iutA），這些質粒都編碼一些潛在的 毒力因子。與此同時，所有經過測序的阪崎克羅諾腸桿菌菌株RepFIB質粒中都含有這兩個鐵獲得系統（eitCBAD和iucABCD/iu tA）。以repA為目標的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分析中發現，大多數阪崎克羅諾腸桿菌都含有與RepF IB相 類似的質粒。這些結果均表明，攜帶鐵獲得系統編碼基因質粒的特性與阪崎克羅諾腸桿菌的生存系統及其隨后侵入宿主系統導致疾病有著非常密切的關系[5]。

2.6 海藻糖的存在

干燥的嬰幼兒配方奶粉的aw僅為0.2，顯然，阪崎克羅諾腸桿菌能在如此干燥的環境中存活很大程度上依賴于該菌對滲透壓的抗性。一般來說，細菌通過增加對滲透壓的抗性來保護自己主要是通過在胞內快速積聚K+等離子來實現。此外，累積的抗滲透壓成分還包括脯氨酸、甘氨酸三甲內鹽和海藻糖等[36]。干燥實際上可以看作是滲透壓力的一種極端形式，細胞需要在無水分的情況下保持生物完整性。根據水分置換原理，多羥基化合物（如：海藻糖）可以替代大分子周圍的一層水膜防止細胞損傷[37]。Breeuwer等[38]研究發現，阪崎克羅諾腸桿菌對干燥和滲透壓存在顯著的抗性，并且分析了阪崎克羅諾腸桿菌在干燥條件下的存活狀況與海藻糖在細胞中積累水平之間的相關性。其中，在穩定期，阪崎克羅諾腸桿菌中蛋白質中海藻糖的含量為0.04 μmol/mg，而干燥的靜止期細胞內，含量則上升到0.23 μmol/mg，海 藻糖含量增加到5倍以上。該研究結果充分表明，海藻糖在細胞內的累積確實與阪崎克羅諾腸桿菌的干燥抗性有關。另外，在對數生長期的阪崎克羅諾腸桿菌培養基中添加海藻糖也可提高干燥處理后該菌的存活率[13,38]。與其他菌株相比， 雖然阪崎克羅諾腸桿菌的抗熱性并沒有隨著海藻糖的積累或添加而顯著提高，但其卻產生了具有更強的抵抗干燥和滲透壓的能力，這種對干燥和滲透壓抗性的提高直接或間接的增強了阪崎克羅諾腸桿菌的致病能力[13]。

2.7 超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBL）

ESBLs是近幾年臨床微生物界非常熱門的名詞，它是一種水解酶，存在于某些革蘭氏陰性桿菌中，導致這些菌對大部分β-內酰胺類抗生素產生 強大的耐藥性[34]。ESBLs的產生由細菌的基因控制，它可通過染色體復制傳給下一代，但真正可怕的是這類基因可經由質粒（plasmid）和轉座子（transposon）傳播給另一個種屬的不同細菌。借助這種能力，ESBLs編碼基因可在細菌間快速傳播，在大量使用抗生素的環境中，不具有ESBLs的細菌很容易遭到淘汰，導致ESBLs菌有逐年增加的趨勢[39]。ESBLs菌不僅造成嚴重的院內感染問題，增加病人死亡率，同時給醫師的抗生素治療造成了極大的困擾[34]。

Zhou Xianfeng等[40]從30種嬰兒配方奶粉中分離出7株阪崎克羅諾腸桿菌和6株肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae），藥敏研究結果表明，每種菌株都對β-內酰胺抗生素有不同水平的抗性，但是對氟喹諾酮和氨基糖苷類抗生素敏感。其中有一株阪崎克羅諾腸桿菌和一株肺炎克雷伯氏桿菌幾乎對所有的頭孢菌素都具有抗性，雙紙片協同實驗結果發現這兩株分離菌含有超廣譜β-內酰胺酶。這是中國首次報道從嬰幼兒配方粉中分離的阪崎克羅諾腸桿菌產生ESBLs，這將意味著阪崎克羅諾腸桿菌對嬰幼兒的感染越來越難以被控制，微生物學家和臨床治療醫師們需投入更多的精力來預防阪崎桿菌導致的感染[40-42]。

2.8 一氧化氮作用（細胞間相互作用）

研究表明，阪崎克羅諾腸桿菌可在小鼠腸上皮細胞中誘導產生大量的一氧化氮，從而導致腸上皮細胞的調亡，但是誘導產生大量一氧化氮的具體機制還不清楚。用保加利亞乳桿菌預處理小鼠模型可以減少一氧化氮的合成，并且可預防腸上皮細胞的凋亡[3,43]。除保加利亞乳桿菌外，很多益生菌都可以預防阪崎克羅諾腸桿菌對腸上皮細胞的傷害，如：嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和乳雙歧桿菌等。這些益生菌可能是單獨或以某種組合通過競爭排斥或抑制來置換已經黏附的阪崎克羅諾腸桿菌，阻止其對宿主的傷害[3,44]。目前，很多研究結果均表明細菌間的相互作用可以影響致病過程，同時也從另一方面揭示了新生兒容易感染包括阪崎克羅諾腸桿菌在內的多種致病菌的部分原因，這可能是由于新生兒腸道內缺乏生態系統相對穩定的正常菌群，導致對阪崎克羅諾腸桿菌感染干預的缺失而造成的結果[3,44]。

3 結 語

嬰幼兒配方粉作為攜帶阪崎克羅諾腸 桿菌的主要食品種類，近年來連續引發了多起與食品安全相關的事件而備受國際相關組織、各國政府的高度重視和消費者的廣泛關注，現行的乳粉衛生標準已不能夠滿足乳粉安全的要求，開展影響乳粉安全的食源性致病菌方面的研究急需而迫切。

阪崎克羅諾腸桿菌從被發現至今，人們對其致病性已有廣泛并且一致的認識，但是對其致病機理目前研究較少，很多機制尚不完清楚，有待進一步深入。本文對已經報道的阪崎克羅諾腸桿菌的致病機制進行了初步總結，以期為深入研究阪崎克羅諾腸桿菌提供參考。

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Progress in Understanding the Pathogenic Mechanism of Cronobacter sakazakii

LIU Mi, YANG Bao-wei*, XIA Xiao-dong, WANG Xin, XI Mei-li
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Cronobacter sakazakii is a gram-negative, sporeless enteric bacillus, and is one of the very important opportunistic foodborne pathogens associated with meningitis, septicemia, and necrotizing enterocolitis in neonates and immunocompromised infants. However, information regarding the pathogenicity and pathogenic mechanism of Cronobacter sakazakii is still limited and not well documented. In this paper, we reviewed the recent progress in the study of the pathogenic mechanism of Cronobacter sakazakii with reference to outer membrane protein A, lipopolysaccharides, biofilm, the host cell cytoskeleton, iron acquisition mechanism, the presence of trehalose, the presence of extended-spectrum β-lactamases, and intercellular interaction.

Cronobacter sakazakii; pathogenicity; mechanism; progress

Q935

A

1002-6630（2014）09-0329-05

10.7506/spkx1002-6630-201409064

2013-05-30

劉咪（1990—），女，碩士研究生，研究方向為微生物食品安全。E-mail：liumi1007@163.com

*通信作者：楊保偉（1974—），男，副教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：ybwsheng@163.com