淺談蛋白質含量的定量檢測方法

周躍男，王湛，趙小川，張西明，高悝，程立娜，劉利萍

（1.北京工業大學環境與能源工程學院，北京100124；2.天津市武清區新聞中心，天津301700）

蛋白質是構成細胞不可缺少的成分，它是生命的物質基礎，與細胞結構、營養代謝、酶等密切相關，它的定量測定是食品和質量檢驗、醫藥分離提純中最重要的工作之一[1]。蛋白質的測定方法也在不斷的發展中，有凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲比色法、Folin-酚法、考馬斯亮藍法、BCA法、磺基水楊酸沉淀法、滴定法及電泳法等方法，本文就常見的這幾種方法進行討論。

1 凱氏定氮法

1.1 原理[2-3]

凱氏定氮法測定蛋白質含量的過程主要分為以下四步：

1）消化。在催化劑和濃H2SO4的作用下，蛋白質加熱消化分解為氨態氮，氨態氮再與濃H2SO4結合生成（NH4）2SO4。

2）蒸餾。消化完全后，加入強堿進行蒸餾，使銨離子轉化為NH3釋放出來。

3）吸收。用標準的H2BO3溶液吸收NH3。

4）滴定。用標準的鹽酸滴定，并用甲基紅為指示劑。測出銨離子的量，最后換算出粗蛋白質的含量。

1.2 特點

凱氏定氮法是目前世界上測定蛋白質樣品中總有機氮的最準確和最簡單的方法之一，廣泛應用于各類蛋白質的測定，可分為常量和微量凱氏定氮法兩種。但存在靈敏度低、操作復雜、耗時過長、試劑消耗量過大等缺點[4]。

1.3 案例

以下兩種方法主要是在消化方式和儀器上進行改進，效果較為滿意。

劉玉蘭等[5]對凱氏定氮法的消化方式進行了改進，用H2O2和濃H2SO4的混合液對蛋白質樣品進行消化，消化完全后再以甲醛法來測定粗蛋白質的含量。該方法的改進效果是：消化時間較經典凱氏定氮法縮短了11/12，同時測定結果與經典凱氏定氮法的測定結果基本一致。說明該方法極大的改善了經典凱氏定氮法的缺點，可用于食品中蛋白質的大批量的測定。

蔣江虹等[6]用2300型全自動凱氏定氮儀測定食品中蛋白質，測定原理與經典凱氏定氮法相同。該方法的改進效果是：該方法因采用機電一體化控制而減少了經典凱氏定氮法過程中人為操作的誤差，具有操作簡便、快速、準確度高等優點。

2 分光光度法

分光光度法分為紫外吸收法、Folin-酚法（Lowry法）、雙縮脲比色法（NH2-CO-NH-CO-NH2法）、考馬斯亮藍法、BCA法（二喹啉甲酸法）等。

2.1 紫外吸收法

2.1.1 原理

因蛋白質分子中芳香族氨基酸等殘基中含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的特性，最大吸收峰在280 nm處。因蛋白質在最大吸收峰處的吸光度與其濃度成正比，可根據蛋白質溶液的吸光度，定量測定測得樣品中蛋白質的含量。

2.1.2 特點

紫外吸收法簡便、快速、靈敏度高，且測定結果不受低濃度的鹽類的干擾[7]。但缺點是：實際應用中的蛋白質，其酪氨酸和色氨酸的含量會和標準蛋白質中的差異較大，導致測定結果存在一定的誤差。因而，適應范圍存在局限，僅適用于與標準蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量差異較小的蛋白質的測定。

2.2 雙縮脲比色法（NH2-CO-NH-CO-NH2法）

2.2.1 原理

因蛋白質含有兩個或者兩個以上肽鍵，它會在堿性條件下與CuSO4溶液發生雙縮脲反應，反應過程中肽鍵中的氮原子和Cu2+結合形成紫紅色的絡合產物[8]。在一定范圍內，絡合產物顏色的深淺與蛋白質的含量符合朗伯—比爾定律。

2.2.2 特點

雙縮脲比色法是2008年公布的中華人民共和國農業行業標準中測定乳與乳制品中蛋白質的方法[9]。作為傳統的分光光度法測定蛋白質的方法之一，雙縮脲法操作簡便、迅速，但缺點是準確度和靈敏度較低，測定范圍也為僅為1 mg～20 mg蛋白質[7]。同時，該測定方法受C4H11NO3、EDTA和一些氨基酸等干擾[10]。

2.3 Folin-酚法（Lowry法）

2.3.1 原理

Folin-酚法與雙縮脲比色法的原理很類似。蛋白質中的肽鍵和Cu2+發生雙縮脲反應，生成蛋白質—銅絡合物。同時，酚試劑被蛋白質-銅絡合物上的芳香族氨基酸殘基還原，生成深藍色的化合物。在一定的條件下，化合物顏色的深淺取決于蛋白質的濃度。因而，可根據蛋白質溶液的吸光度，定量測定測得樣品中蛋白質的含量。

2.3.2 特點

Folin-酚法廣泛應用于測定水溶性蛋白質的含量，較雙縮脲法更靈敏。適用于20 μg～250 μg微量蛋白質的測定，最低可達5 μg[7]。但缺點是：Folin-酚試劑配制繁瑣耗，且會受到檸檬酸、甘氨酸、Tris緩沖液、甘油[7]、還原劑（二硫代蘇糖醇、巰基乙醇）[11]、EDTA 和脲素[12]物質的干擾。

2.4 考馬斯亮藍法（Bradford法）

2.4.1 原理

考馬斯亮藍法是Bradford于1976年提出的快速、靈敏的定量測定微量蛋白質的方法。

考馬斯亮藍G-250染料是一種有機染料，它在游離狀態下為紅色，最大吸收峰在465 nm處。但當它與稀酸中的蛋白質的芳香族氨基酸和堿性氨基酸殘基通過范德華力結合后，會由紅色變成藍色，最大吸收峰變為595 nm。在一定條件下，蛋白質-G-250絡合物在595 nm處的吸光度與蛋白質的濃度呈線性關系，故可用于測定蛋白質的含量。

2.4.2 特點

考馬斯亮藍法測定快速、簡便、穩定性好、靈敏度高、重現性好、干擾物質較少。但缺點是：該方法的線性關系會隨著在蛋白質含量的增加而越來越偏差，同時，當蛋白質的芳香族氨基酸和堿性氨基酸殘基含量不同時，它與考馬斯亮藍G-250的結合狀況也會不同，因而在不同蛋白質含量的測定中有偏差。同時，此外，該反應會受強堿性緩沖液、十二烷基硫酸鈉（SDS）、去污劑、TritonX-100 等物質的干擾[7]。

2.4.3 案例

以下方法主要是在標準曲線和顯色液組分方面進行改進，效果較為滿意。

郭敏亮[13]等通過研究發現，顯色液組分中的H+是影響線性關系的最主要的因素，摒棄傳統的H3PO4緩沖溶液，用一個全新的顯色液配方來改善了考馬斯亮藍法測定蛋白質的線性關系。

余冰賓[7]在基礎生物化學實驗指導一書中，提到采用γ-球蛋白作為標準物質，可減少因蛋白質來源的差異造成的測定偏差。

2.5 BCA法（二喹啉甲酸法）

2.5.1 原理

BCA法測定蛋白質含量的過程主要分為以下兩步[14]：

1）還原。在堿性條件下，蛋白質將Cu2+還原成Cu+。

2）絡合。Cu+與BAC試劑發生反應，在最大吸收峰（562 nm）下處形成紫紅色的絡合物。一定條件下，絡合物顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，因而可用于蛋白質含量的測定。

2.5.2 特點

相比Lowry法，BCA法更優越。它是已知的最靈敏的總蛋白質含量的檢測方法之一，檢測下限到0.5μg[15]。具有快速、穩定、靈敏等優點。

2.6 磺基水楊酸沉淀法[16]

2.6.1 原理

以磺基水楊酸和無水硫酸鈉為試劑，采用磺基水楊酸沉淀法來測定生物制品中的蛋白質的含量。

2.6.2 特點

磺基水楊酸沉淀法測定快速、簡便、操作誤差小，雖然與凱氏定氮法與Folin-酚法相比準確性偏低，但磺基水楊酸沉淀法有如下優點：（1）克服了凱氏定氮法對蛋白質的濃度過低而致使測定誤差大的缺點；（2）彌補了Folin-酚法中由于蛋白質樣品中硫柳汞等存在而干擾檢測結果的劣勢。因而，磺基水楊酸沉淀法不失為一種微量蛋白質的行之有效的方法。

3 滴定法

3.1 原理

滴定法測定蛋白質含量的過程主要分為以下兩步：1）消化。該步與凱氏定氮法一致。

2）滴定。用甲醛滴定法或pH滴定法進行滴定。

由于凱氏定氮法存在操作復雜、耗時過長、試劑消耗量過大等缺點，一些研究人員在樣品消化后，省去傳統凱氏定氮法中蒸餾和吸收兩步，直接采用滴定法測定蛋白質含量。

3.2 特點

該法省去凱氏定氮法中蒸餾和吸收兩步，克服了凱氏定氮法中的一些缺點，操作簡便、快速，不失為一種行之有效的方法。

3.3 案例

馮正滔[17]改善了傳統凱氏定氮法，用甲醛法代替蒸餾、吸收、滴定三步。改進后的方法平均回收率和精密度都有了明顯提高，同時也克服了傳統凱氏定氮法的缺點，為一種可行的測定蛋白質含量的方法。

張大倫等[18]以滴定極弱酸的原理為根據，同樣改善了傳統凱氏定氮法，用pH滴定法代替蒸餾、吸收、滴定三步，分別測定了大豆及花生蛋白質的含量。結果表明，pH滴定法的測定不僅與傳統凱氏定氮法測定結果基本一致，而且經濟效益明顯，應用前景廣泛。

4 電泳法

4.1 原理

在電場作用下，惰性支持介質中帶電荷的樣品（如蛋白質）向著與其電荷相反的電極方向移動，由于各組分移動速度的差異，使其在電泳區帶圖譜上形成狹窄的區帶，根據譜圖可計算樣品中蛋白質的百分含量。

4.2 特點

電泳法具有操作簡便、快速、自動化程度高等優點。但缺點是：在檢測過程中會受脂類、核酸、多糖等的干擾分子。目前，測定蛋白質含量的電泳法可分為毛細管電泳法、雙向凝膠電泳法、火箭免疫電泳法等。

4.3 案例

唐萍等[19]通過毛細管電泳法測定雀巢、美贊臣、雅培等知名品牌嬰幼兒奶粉中多種蛋白質的含量。研究表明，該法準測定快、精密度和準確度高、綠色無污染，同時它對改善幼兒奶粉配方和監控牛奶的質量提供了一個較好的檢測方法。

5 結論

定量檢測蛋白質含量的方法有很多，包括：凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲比色法、Folin-酚法、考馬斯亮藍法、BCA法、磺基水楊酸沉淀法、滴定法及電泳法等。每種檢測方法各有優缺點，我們應充分了解這些測定方法的原理和特點，并在科研檢測工作中根據具體的情況選用適宜的、常用的分析方法，這樣才能獲得更好的檢測結果。

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