腺相關病毒Rep78/68蛋白功能的研究進展

占申標呂穎慧，2李招發，2

（1.華僑大學分子藥物研究院，泉州 362021；2.分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021）

腺相關病毒Rep78/68蛋白功能的研究進展

占申標1呂穎慧1，2李招發1，2

（1.華僑大學分子藥物研究院，泉州 362021；2.分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021）

Rep78/68是腺相關病毒（AAV）基因組編碼的具有多種調控功能的非結構蛋白。主要參與了AAV DNA定點整合到人類19號染色體，抑制病毒的生物活性，如腺病毒、類猿病毒SV40等，調節AAV DNA的復制和轉錄等。重點闡述了定點整合的作用機制，Rep78/AAV ITR /ICP8復合物的形成機制以及Rep68蛋白的寡聚化特性，Rep78蛋白對p53核輸出的限制，AAV Rep78蛋白與人乳頭瘤病毒（HPV）E1蛋白相互作用從而促使Rep78和ITR DNA的結合，Rep78對乙型肝炎病毒（HBV）的抑制。這些作用的詳細機制仍需完善和充實，對Rep78/68蛋白的相關作用機制的深入研究有助于rAAV基因藥物的研發。

AAV Rep78 Rep68 p53 機制

腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）為復制缺陷型病毒，是細小病毒家族的一個成員，具有一系列特征，能將基因組定點整合到人類基因組19號染色體特定區域（19q13.42-qter）：AAVS1［1-3］，并且沒有發現與人類疾病有關，是基因治療的理想載體［4］。AAV的有效感染通常需要輔助病毒的存在，如腺病毒（Ad）、皰疹病毒（herpes virus）和人乳頭瘤病毒（HPV）等［5］。AAV基因組為4.7 kb的單鏈DNA（ss-DNA），兩個末端是倒轉重復序列（ITR），它是AAV基因組復制和包裝所必須的唯一順式作用元件［6，7］。ITR序列之間包含兩個開放閱讀框架，稱為Rep和Cap，分別編碼4個非結構蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和3個結構性蛋白（VP1、VP2和VP3）［8］。另外，Cap基因的開放閱讀框2還編碼裝配激活蛋白（AAP）［9-11］。Rep78和Rep68蛋白在AAV的生命周期中扮演著相當重要的角色，這兩個蛋白的深入研究，對重組腺相關病毒（rAAV）介導的基因治療意義深遠。基于此，本文主要闡述了Rep78和Rep68蛋白一些相關作用的機制研究。

1 Rep78/68的結構

4個非結構的Rep蛋白分別由p5和p19啟動子起始的mRNA通過選擇性剪接后翻譯而得。Rep78和它的剪接異構體Rep68由p5啟動子起始的2種mRNA翻譯，Rep52和它的剪接異構體Rep40由p19啟動子起始的2種mRNA翻譯［12］（圖1）。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分別與Rep78和Rep68相同。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的活性結構域。在輔助病毒存在時，兩個大的Rep蛋白序列和功能很是相似，Rep78/68蛋白可以和ITR中的特定序列結合。類似的序列在AAV的3個啟動子上游也都存在。這兩種蛋白對于AAV生活周期的每一時期都是必需的。能夠完成一系列復雜的功能，Rep蛋白肯定能與細胞內的一些蛋白，以及輔助病毒的蛋白產生相互作用，迄今為止，對這些相互作用的研究還不是很透徹［13］。

2 Rep78/68協助AAV基因組定點整合

腺相關病毒能將基因組定點整合到人類19號染色體上的特定位點AAVS1（圖2）。Surosky等［14］利用PCR技術鑒定得知，在一些特定的細胞中，AAV基因組能整合到AAVS1。通過這個試驗發現，無論是順式或者反式的AAV Rep蛋白，對于定點整合都起著決定性的作用。而且只有兩個大的Rep蛋白（Rep78和Rep68）參與了定點整合這一過程。另外，順式的AAV末端倒轉重復序列（ITR）對于定點整合到AAVS1并非必不可少，但可以提高整合的效率。ITR包含一個Rep蛋白結合位點（RBS）和能被Rep蛋白的剪切活性識別的末端決定位點（TRS）［15］，RBS 由串聯重復序列的四聚物GAGC組成［14］，Rep78/68可特異識別（GAGC）4DNA序列，這一序列被稱為Rep識別序列（RRS），人類的19號染色體AAVS1就存在于RRS序列中。體外的結合試驗表明：Rep78/68與AAV DNA結合以及剪切功能在AAV定點整合過程中發揮著很重要的作用，Rep78/68能夠調節AAV ITR 和AAVS1上包含RBS和TRS的一段109 bp的序列之間復合物的形成［16］。如果將RRS或TRS序列突變，定點整合就無法進行［17］。其中，可以肯定有許多未知的胞內蛋白也都參與了整合過程，但是至今還沒有研究清楚［17-19］。

通過一系列的體外或者體內的試驗都可以得到如下的結論：首先，AAV ITR和AAVS1中的RBS在Rep78/68的作用下得以靠近［16，20］；其次，形成Rep介導復合物，并且推測Rep78/68特異剪切ITR和AAVS1的特定位點；最后，以非同源重組的方式進行位點整合［17，21］。

Surosky和Urabe等［14］驗證了利用兩個質粒來實現定點整合：分別是包含AAV ITR的質粒和AAV Rep蛋白的質粒。這個系統的優點是沒有病毒被包裝，也就沒有整合序列大小的限制，對于基因治療的發展頗有意義。

雖然Rep78/68對于AAV的定點整合和長期有效表達是必須的，但還無法確定Rep78/68是否僅僅只促進了定點整合這一過程，也許Rep78/68也作用于其他的一些隨機整合。由于Rep78/68能夠高效的與RBS結合，推測Rep78/68可能促進隨機整合或者定點整合于與野生型RBS有一點相似的位點［22］。

Philpott等［23］通過研究發現，AAV ITR不是介導定點整合的必要條件。在Rep78/68存在時，由于138 bp的順式P5整合效率元件（P5IEE）作用，定點整合依然會發生。為此，又提出最新的定點整合機制：Rep蛋白與AAVS1位點特異結合，發生剪切，出現AAVS1位點的擴增和重排，而且Rep蛋白與AAV P5IEE結合，這樣兩個模板就相互靠近，在復制時發生置換或重組，定點整合也便得以進行了［24］。

3 Rep78/Rep68調節AAV DNA的復制和轉錄

3.1 Rep78引導的Rep78/AAV ITR/ICP8三元復合物

的形成

單純皰疹病毒（HSV）的ICP8蛋白以及UL5/ UL18/UL52的解旋酶-引物酶復合體構成的異源三聚體所形成的4個蛋白復合物參與了AAV DNA的復制［25］。其中，解旋酶UL5和引物酶UL52能夠吸引Rep蛋白和AAV基因組，從而起始AAV DNA的復制［26，27］。

Alex等［28-30］通過試驗發現：在體外，Rep78的C末端缺失的突變型仍有與ICP8和AAV ss-DNA相互作用的能力，而N末端缺失的突變型在體內沒有顯示出促使AAV DNA復制的趨勢。Rep78的C末端主要包含了核定位信號序列，N末端則有與AAV ITR上RBS定點結合的結構域和內切酶活性。另外，研究表明：Rep78與AAV ITR的直接接觸為三元復合物的形成所必需。Rep和ICP8在核復制區域的共區域化依賴于Rep與AAV ITR的結合和解開ITR雙鏈能力。Rep78/68與AAV ITR的RBS結合，解開AAV ITR的雙鏈，牽引ICP8、解旋酶與引物酶復合物以及其他的復制相關因子，然后ICP8迅速與ss-DNA區域結合。這兩個進程是否有相互作用至今還無法確定。接下來由于蛋白與蛋白的相互作用，三元復合物得以形成。

3.2 AAV-2 Rep68蛋白的區域連接是寡聚化進程的重要組成部分

AAV的4個Rep蛋白相互協調，共同作用于腺相關病毒生命周期的各個方面：包括轉錄調節、DNA復制、病毒包裝及定點整合。所有的Rep蛋白都有一個SF3超家族解旋酶結構域，在其他的SF3家族中，這一結構域能有效地誘使寡聚化，然而依據AAV Rep蛋白單體的特性，發現AAV Rep蛋白中的解旋酶結構域無法調節穩定的寡聚化［31］。

Zarate-Perez等［31］推測存在一個未知的決定性結構來調節Rep蛋白的寡聚化。通過比較AAV-2 Rep蛋白的解旋酶結構域和其他的SF3家族的解旋酶結構域發現，Rep蛋白解旋酶結構域的小寡聚亞結構存在一個主要結構，與其他的SF3解旋酶結構域有明顯的差異。此外，Rep蛋白的解旋酶結構域和自身的起始結合區域（OBD）結合的二級結構預測模型表明有形成α-螺旋的潛力。其中，Rep蛋白的芳香族連接基團（Y224）對寡聚化至關重要，它是SF3解旋酶的保守序列。這個基團的突變明顯影響寡聚化作用，并且使產生感染性病毒的能力完全喪失。總之，可以假設一個寡聚化機制模型：在解旋酶結構域折疊形成α-螺旋之前，Y224能夠成為解旋酶結構域整體的一部分，對寡聚化至關重要，同時通過與OBD和解旋酶結構域相互合作來對Rep68蛋白的功能發揮重要影響［31］。

AAV-2 Rep68蛋白的區域連接是它的寡聚化進程的一部分，在寡聚化過程中發揮重要的作用［31］。

4 Rep78/Rep68抑制病毒的生物活性以及對輔助病毒的依賴性

4.1 AAV Rep78限制腺病毒E1B55K調節的p53核輸出

p53是重要的細胞轉錄因子，可以抑制癌癥的發生［32］，參與細胞周期的循環，當有嚴重的DNA損傷時能夠誘發細胞凋亡［33］。E1B55K蛋白是腺病毒的早期基因產物，能與p53的氨基末端轉錄調節區結合［34］，形成復合物，從而可以誘使p53從核內轉移到細胞質，這樣就達到了抑制p53的調節轉錄效應［35］。其中，E1B55K-p53的相互作用的發生依賴于E1B55K的寡聚化和p53的四聚體化［36］。而AAV能夠使p53不被腺病毒影響，這對癌癥的治療起著特殊的意義。研究表明：在腺病毒和AAV共轉染的細胞中，Rep78和p53會形成復合物［37］，但是AAV如何影響E1B55K抑制p53相關活性的準確機制還沒有弄清楚。Wang等［38］發現AAV-2的Rep78蛋白能抑制腺病毒5型E1B55K調節的p53核輸出這一進程，但不能直接影響p53的穩定性，也不能緩解對p53的轉錄調節活性的抑制作用。

Wang等［38］通過共聚熒光分析發現，當Rep78、E1B55K和p53在H1299細胞中共表達時，Rep78會抑制E1B55K與p53的相互靠近，也能促使E1B55K重新定位。E1B55K具有E3 SUMO1-p53連接酶的功能，可以誘使p53與E1B55K在白血病基因核體（PML-NBs）處共區域化，從而使得p53的核輸出得以實現［39］。Rep78 也許能夠抑制p53共區域化后的核輸出，具體的機制還未弄清。

Rep78蛋白并沒有被發現直接影響p53的降解和E1B55K的抑制作用。雖然Rep78也能與p53相結合，但是不能從p53-E1B55K復合物中取代E1B55K。Rep78能夠引導p53重新定位于核內，但E1B55K依然與p53共區域化。因此，E1B55K 仍然和p53的氨基末端轉錄調節區域結合，這也就解釋了雖然p53在核內大量積累，但p53的穩定性以及轉錄調節活性沒有增加。也許，p53、E1B55K和Rep78共同表達時能形成三聚體復合物，E1B55K也可能與Rep78結合［13］。

雖然在E1B55K存在下，Rep78不直接影響p53的穩定性或轉錄調節活性，但能使p53和E1B55K在核內重定位。目前還不清楚是否有其他的作用影響這一過程。Rep78通過限制p53的核輸出來抑制腺病毒5型的作用這一新的機制，對我們研究腺病毒這一輔助病毒對AAV的調節有著重大意義［38］。

4.2 AAV Rep78和HPV E1相互作用，促使Rep78和ITR DNA結合

AAV 的相關生命活動需要輔助病毒提供幫助，才能正常進行［40］。如人乳頭瘤病毒16型（HPV）E1蛋白對AAV2的生命周期就可提供幫助，可以提高AAV DNA、mRNA，以及一些相關蛋白的表達水平。與AAV Rep78類似，E1是HPV的復制蛋白，但E1沒有Rep78的內切酶和共價結合活性。E1和Rep78在體外可以相互作用，利用從細菌中提純的Rep78和E1蛋白，研究在體外E1蛋白對Rep78與AAV ITR DNA相互作用的影響。E1能夠增強Rep78-ITR的結合、ATP酶活、Rep78-ITR的共價連接以及Rep78-ITR的內切酶活性，這種增強作用有明顯的劑量依賴關系。然而，E1和Rep78相互作用后的Rep78解旋酶活性明顯要比Rep78單獨時的解旋酶活性低。研究表明，E1之所以能對AAV的生命周期進行廣泛的調節，是由于E1可以增強Rep78與ITR DNA結合至關重要的區域的生化特性［5］。

解旋酶活性改變不是E1蛋白誘發AAV更有效復制的直接機制，在HPV E1存在下，Rep-ITR復合物的相關功能增強，但是E1不能直接與ITR結合。E1蛋白能夠增強Rep78 在AAV ITR上的內切酶活性和共價結合能力。因此，可能正是由于這個原因，E1蛋白才能促使Rep78和ITR的結合作用。E1可以增強Rep78在目標DNA上形成寡聚物的能力，多樣的Rep78寡聚物與AAV ITR DNA相結合，其中ATP會促進部分的寡聚物形成。而且，E1蛋白也能夠增強Rep78蛋白的ATP酶活性。ATP酶活性又會影響解旋酶、內切酶活性以及共價結合。總之，通過增強Rep78的關鍵位點的生化特性，E1蛋白便可以促進Rep78與ITR DNA的結合，進而對AAV生命周期的相關進程產生重要作用［5］。

4.3 AAV Rep78蛋白抑制乙型肝炎病毒（HBV）

AAV可以抑制人乳頭瘤病毒（HPV）、腺病毒、人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒和類猿病毒SV40等，1989年首次報道將AAV抑制病毒的作用歸結于Rep78蛋白的作用。

劉天會等［41］利用PCR技術擴增HBV-S、C和X基因。通過凝膠電泳阻滯試驗（EMSA），可以檢測到Rep78蛋白在體外能夠與HBV-S、C和X的DNA相結合，并且與HBV-C的結合能力最強，還發現隨著Rep78 劑量增多，結合能力更強，呈一定的劑量依賴關系。劉天會等［41］研究表明AAV Rep78蛋白可與HBC-C啟動子特異結合，從而下調其轉錄［42］。因此，可以推測AAV-Rep78抑制HBV DNA復制的機制就是Rep78蛋白結合并抑制了HBV-C基因，這為抗HBV提供了一些新思路，更重要的是可以改善rAAV載體在基因治療中的應用。

5 展望

Rep78/68在腺相關病毒生命周期中有著很多重要的作用：Rep78/68蛋白的表達對AAV病毒從整合狀態的拯救、各種AAV基因的表達和AAV DNA的復制都是必需的。另外，Rep的表達能夠抑制腺病毒（Ad）、猿猴病毒40（SV40）、人乳頭瘤病毒（HPV）、艾滋病毒（HIV）和皰疹病毒的傳播。 Rep 78和Rep68蛋白與AAV基因表達的正負調控有關［4］。總之，Rep78和Rep68蛋白在AAV的生命周期中起著至關重要的作用，雖然我們對其中的一些作用的機理有了一定程度的認識，但許多與Rep蛋白相關的作用的具體機制仍然還需探索。例如，Rep78/68對AAV DNA定點整合到人類19號染色體作用的最合理、最準確的機制還不是很清楚，Rep78抑制的p53-E1B55KHPV 共區域化后的p53核輸出的具體機制研究的也不是十分清楚，E1上調的 AAV Rep78蛋白調節復制能力的具體區域，以及具體的生化特性，以及Y224影響Rep蛋白寡聚化詳細機理。對Rep蛋白的深入研究有助于AAV的探究，可以促進rAAV介導的基因治療的發展［43，44］，其意義深遠。

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（責任編輯 狄艷紅）

Progress in the Research Regarding to the Function of Protein Rep78/68

Zhan Shenbiao1Lü Yinghui1，2Li Zhaofa1，2
（1.Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2.Molecular Medicine Engineering Research Center，Ministry of Education，Quanzhou 362021）

Rep78/68, a type of nonstructural proteins encoded by adeno-associated virus（AAV）genome, have a variety of control functions. Rep78/68 promote the integration of AAV DNA site-specific into human chromosome 19, suppress the virus biological activity, such as adenovirus, simian virus 40, adjust the AAV DNA replication and transcription, etc. This paper mainly discusses the mechanism of site-specific integration, the mechanism of Rep78 / AAV ITR/ICP8 complex formation and the characteristics of the oligomerization of Rep68 protein, the limit of the nuclear output of p53 by Rep78 protein, the interaction between AAV Rep78 and human papilloma virus（HPV）E1 protein prompt the combination of Rep78 and ITR DNA, inhibition of the hepatitis B virus（HBV）by Rep78. While the detailed mechanism still remaines to be improved and enriched, further elucidatation of Rep78/68 protein related mechanism may improve the production technology of rAAV and develop gene drug based on rAAV, which has a great significance.

AAV Rep78 Rep68 p53 Mechanism

2013-09-14

國家自然科學青年科學基金項目 （81201183），中央高校基本科研業務費資助項目 （JB-ZR1142）

占申標，男，碩士研究生，研究方向：基因工程；E-mail：1200416004@hqu.edu.cn

李招發，男，博士，副研究員，研究方向：基因工程，生物醫學工程；E-mail：lizhaofa@hqu.edu.cn