基于流感病毒PAN蛋白的高通量藥物篩選

張國防李真真姚偉利王麗君朱顯明

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300222；2. 天津市國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457；3. 南開大學藥學院，天津 300071；4. 南開大學生命科學學院，天津 300071；5. 天津市國際生物醫藥聯合研究院有限公司，天津 300457）

基于流感病毒PAN蛋白的高通量藥物篩選

張國防1李真真1姚偉利2，3王麗君2，4朱顯明5

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300222；2. 天津市國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457；3. 南開大學藥學院，天津 300071；4. 南開大學生命科學學院，天津 300071；5. 天津市國際生物醫藥聯合研究院有限公司，天津 300457）

流感病毒的PAN蛋白高度保守，并且具有核酸內切酶活性，是抗流感藥物研發的潛在靶點。通過高通量藥物篩選體系，從372種化合物中篩選出3種對流感病毒H5N1的PAN蛋白抑制作用較好的化合物。將這3種化合物分別與PAN蛋白進行分子對接模擬，結果顯示它們均可以與PAN蛋白活性位點的二價金屬離子和氨基酸殘基相互作用，從而為抗流感病毒藥物的發現提供了先導化合物。

流感病毒 PAN蛋白 高通量藥物篩選 分子對接 化合物

流感是由流感病毒引起的傳染性極強的急性呼吸道感染。20世紀以來，全球發生過多次大規模的流感疫情。由于流感病毒容易發生基因重組而導致抗原變異，人體的免疫系統不能有效抵御病毒的攻擊，因此每一次周期性的流感爆發都會給人類健康和養禽業造成嚴重危害。流感病毒可以借助空氣或者接觸傳播，傳播迅速并且波及范圍廣泛，曾經爆發的H5N1高致病性禽流感病毒突破種屬天然屏障，已經被證實了具有有效的人-人傳染的能力，感染人時致死率高達63%［1-3］。2013年3月底，我國上海和安徽兩地率先發現3例人感染H7N9禽流感病例。據國家衛生和計劃生育委員會統計數據，截至2013年8月31日，我國內地共報告134例人感染H7N9禽流感確診病例，其中死亡45人，康復86例，分布于12個省市的42個地市。目前，能夠有效治療流感的藥物非常有限，尋找新的藥物靶標，研究新的抗流感藥物是藥物研發領域亟待解決的重要問題之一。

流感病毒屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒屬的一類RNA病毒［4］，其RNA聚合酶（RNA polymerase）存在于被感染者宿主細胞的細胞核中，由PB1、PB2和PA三個蛋白質亞基組成。PA亞基是一種酸性蛋白，在流感病毒RNA聚合酶中分子量最小。研究發現PA亞基具有絲氨酸蛋白酶活性和核酸內切酶活性，參與病毒復制、轉錄及組裝等多個生命過程。PA亞基可以被胰蛋白酶切割成30 kD的PAN（1-256）和55 kD的PAC（257-756），其中PAN蛋白的二級序列由7個α螺旋、5個β折疊及一些無規卷曲組成，具有與5'帽子結構和cRNA啟動子結合，穩定聚合酶等多種功能。更重要的是PAN蛋白具有核酸內切酶常見的（P）DXN（D/E）XK序列，其核酸內切酶活性口袋部位存在His41、Glu80、Lys134、Asp108、Glu119五個關鍵氨基酸殘基，這5個氨基酸殘基在各種禽流感病毒中高度保守［5，6］，因此PAN被認為是新型抗流感藥物研發的潛在靶點［5-7］。本研究通過高通量藥物篩選的方法，從372種化合物中篩選出來3種對流感病毒H5N1的PAN蛋白具有抑制作用的化合物，旨在為抗流感病毒藥物的研發提供先導化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6P-1由天津市國際生物醫藥聯合研究院高通量分子藥物篩選中心提供，作為表達載體用。菌株：感受態細胞E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）pLysS購自于北京全式金生物技術有限公司?；颍篜AN基因來自于流感病毒A / goose / Guangdong / 1 / 96（H5N1），含有該目的基因的質粒由高通量分子藥物篩選中心構建并保存。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒構建及蛋白純化 以含有流感病毒H5N1的PAN基因的質粒作為模板，使用Primer premier 5.0軟件設計引物，5'端引物為CGCGGATCCATGGAAGACTTTGTGC，3'端引物為CCGCTCGAGTTATCTGGCGTTTACTT。擴增后的PCR產物和pGEX-6P-1載體使用BamH I和XhoI雙酶切后進行連接。重組質粒經基因測序后轉化E.coliBL21（DE3）pLysS感受態細胞。挑取單克隆至5 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，于37℃，220 r/min搖床培養8 h后按0.6%接種量接種到800 mL LB培養基中，相同條件下培養至OD600為0.6-0.8，將搖床降溫至16℃，加入400 μL 1 mol/L的IPTG溶液誘導后繼續培養16 h，離心收集菌體（4℃，5 500 r/min）。使用30 mL 4℃預冷的1×PBS（pH8.0）重懸菌體，超聲破菌40 min（320 W，4℃），4℃，1 5000 r/min離心，收集含有目的蛋白的上清液。

按照Glutathione Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）親和層析介質使用說明方法進行重組PAN蛋白的初步純化。將含有目的蛋白的上清液通過層析柱，然后用1×PBS（pH8.0）沖洗雜蛋白后，向層析柱中加入100 μL 104U/mg PreScission蛋白酶，于4℃，100 r/min搖床酶切12 h，將目的蛋白從GST標簽上切下。用20 mL PAN蛋白緩沖液（20 mmol/L Tris pH8.0，150 mmol/L NaCl）洗脫PAN目的蛋白。使用Superdex 200 10/300 GL凝膠過濾層析柱（GE Healthcare）進一步純化目的蛋白，收集蛋白樣，進行SDS-PAGE檢測。

1.2.2 高通量藥物篩選 流感病毒PAN蛋白是廣譜的金屬依賴型核酸內切酶，既可以切割單鏈DNA、RNA，也可以切割雙鏈的DNA、RNA。這種非特異性的識別和切割活性需要二價金屬離子的參與，研究表明Mn2+的結合要優于Mg2+［8，9］。EDTA是金屬離子螯合劑，可以螯合Mn2+，從而導致PAN蛋白不能發揮核酸內切酶活性。基于這一原理，采用體外熒光檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測兩種藥物篩選方法對化合物庫進行PAN蛋白的藥物篩選。

1.2.2.1 體外熒光檢測方法進行藥物篩選 基于熒光共振能量轉移方法［10，11］，設計了AA核酸片段，在該片段5'端標記FAM熒光基團，在3'端標記BHQ1熒光淬滅基團，即以FAM 5'-AA-3'BHQ1作為PAN的酶切底物，通過抑制率檢測藥物對酶的抑制作用，通過熒光淬滅率排除假陽性結果，通過IC50值檢測PAN蛋白活性被抑制一半時抑制劑的濃度。以陰性對照的酶活曲線最大斜率值為酶促反應速率V0，加入藥物后酶活曲線最大斜率值為酶促反應速率Vi，抑制率（Ir）的表示方式如下：

抑制率（Ir）的檢測：在96孔板中加入15 μL 0.5 mg/mL的PAN蛋白溶液、15 μL 10 mmol/L MgCl2和MnCl2溶液、9 μL 20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液、1 μL 50 mg/mL待測化合物和10 μL 30 μmol/L FAM 5'-AA-3'BHQ1底物；陰性對照中，將1 μL待測樣品換成1 μL 95% DMSO；陽性對照中，將1 μL待測樣品換成1 μL 0.5 mmol/L EDTA溶液；震蕩混勻，酶標儀在激發光為492 nm時，間隔30 s在發射光波長527 nm處測20次熒光值。

熒光淬滅率（Qr）的檢測：在96孔板中依次加入15 μL 10 mmol/L氯化鎂和氯化錳溶液、24 μL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、10 μL 30 μmol/L底物（5’FAM-AA），震蕩混勻，在激發光和發射光波長分別為492 nm和527 nm處，間隔30 s測20次熒光值，所測熒光值記為Q1；在待測孔中加入1 μL 50 mg/mL藥物，在對照孔中加入1 μL 95% DMSO。震蕩混勻，酶標儀在激發光為492 nm時，間隔30 s在發射光波長527 nm處測20次熒光值，所測熒光值記為Q2；熒光淬滅率的計算式為：

IC50值的檢測：將篩選出來的抑制作用較大的藥物依次稀釋成16個不同的濃度梯度，在這些濃度下檢測該抑制劑對PAN蛋白活性抑制一半時的濃度，最后以抑制劑濃度的對數值為橫坐標，剩余活性（Ra）為縱坐標，利用GraphPad Prism 5軟件將這些點進行擬合，計算出該抑制劑的IC50值。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳進行藥物篩選 瓊脂糖凝膠電泳藥物篩選以pGEX-6P-1質粒為底物，當加入PAN蛋白，其發揮核酸內切酶活性，質粒將被切散，瓊脂糖凝膠電泳顯示彌散條帶。當體系中同時加入藥物和PAN蛋白后，若藥物對PAN蛋白的核酸內切酶活性有抑制作用，則瓊脂糖凝膠電泳顯示質粒未被切割的狀態，若無抑制作用，則瓊脂糖凝膠電泳顯示彌散條帶。

在1.5 mL EP管中分別加入2 μL 0.5 mg/mL PAN蛋 白、2 μL 10 mmol/L MgCl2和MnCl2溶 液、1 μL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、1 μL 50 mg/mL的 待測樣品；陰性對照中，將1 μL待測樣品換成1 μL 95%DMSO；陽性對照中，將1 μL待測樣品換成1 μL 0.5 mol/L EDTA；各組分混勻后于37℃孵育10 min。每個EP管中加入4 μL 200 ng/μL的pGEX-6P-1質粒，混勻后于37℃孵育30 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒存在狀態。

1.2.3 抑制劑與蛋白質分子對接的驗證 分子對接（Mocular docking）是計算機輔助藥物設計（Computer aided drug design，CADD）常用的方法之一。利用計算化學原理模擬化合物分子與受體生物大分子的相互作用，分析已知化合物和藥物靶標之間的構效關系（Structure activity relationship，SAR），從而設計結構新穎的先導化合物［12，13］。

2 結果

2.1 質粒的構建和蛋白表達的鑒定

771 bp的PAN目的基因和4.9 kb的表達載體連接后轉入E.coliDH5α中，陽性單克隆提取質粒后用BamH I和XhoI雙酶切鑒定（圖1）顯示，4.9 kb的載體條帶和771 bp的目的基因條帶，確定重組成功。利用GST親和層析柱進行PAN蛋白的初步純化，經過Superdex 200 10/300 GL預裝柱進行凝膠過濾層析進一步純化，得到大小為30 kD的PAN蛋白（圖2）。

2.2 高通量藥物篩選結果

2.2.1 熒光檢測法篩選結果 對化合物庫中的372種化合物進行體外熒光檢測，結果如表1所示。抑制率越高，熒光淬滅率越低的化合物對PAN蛋白抑制作用越強。其中Ir≥80%，Qr≤30%的化合物共有8種，分別為MDCCCL001302，MDCCCL001311，JYCCL002021，MDCCCL002107，MDCCCL001315，MDCCCL001316，MDCCCL001319，MDCCCL001320。

2.2.2 IC50檢測結果 將熒光檢測中Ir≥80%，Qr≤30%的8種化合物進行IC50的測定，如圖3所示，化合物MDCCCL001302，MDCCCL001311，JYCCL-002021，MDCCCL002107，MDCCCL001315，MDCCCL001316，MDCCCL001319，MDCCCL001320的IC50值分別為56、143、135.2、149.3、35.5、83.3、125.5、125.5 μmol/L。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光法中Ir≥80%，Qr≤30%的8種化合物對PAN蛋白的抑制活性，結果如圖4所示。由于質?；拘螒B可分為3類：超螺旋，線形和開環，所以抽提的質粒電泳檢測時可能會出現一條或多條條帶。從圖4中可以看到加入化合物MDCCCL001302（泳道3）、MDCCCL001315（泳道7）、MDCCCL001316（泳道8）后，質粒在凝膠中的狀態同原始質粒（泳道0）和陽性對照（泳道2）相同，為兩條條帶，表明這些化合物的加入抑制了PAN蛋白的核酸內切酶活性。其他5種化合物加入后，質粒在凝膠中的狀態同陰性對照（泳道1）相同，呈彌散條帶，表明這些化合物的加入對PAN蛋白的核酸內切酶活性無明顯抑制作用。

2.2.4 綜合篩選結果 綜合體外熒光檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測兩種方法篩選結果和IC50值，篩選出來3種對PAN蛋白有較強抑制作用的化合物， 分 別 為MDCCCL001302、MDCCCL 001315、MDCCCL001316，綜合篩選結果見表2。

2.2.5 抑制劑與蛋白質的分子對接結果 2012年文獻報道了PAN蛋白與EGCG共晶結果（PDB ID：4AWM）［14］，如圖5-A所示，證實了EGCG具有較強的PAN核酸內切酶抑制作用，其沒食子酰基是必需基團，可以與活性口袋很好地契合，而且沒食子酰基的羥基氧可以與活性口袋處的親水性氨基酸形成穩定的氫鍵，從而抑制了PAN蛋白的核酸內切酶活性。

將篩選出來的3種化合物分別與PAN蛋白進行分子對接，如圖5-B、圖5-C和圖5-D所示。與EGCG對比發現：化合物MDCCCL001315和MDCCCL001316的共同結構特征是含有3，4-二羥基苯丙烯基，其苯環上鄰位的兩個羥基氧與活性中心的錳離子之間形成配位鍵，同時也可以作為氫鍵受體或供體與其他基團（如羰基氧）協同作用，同活性口袋內的關鍵氨基酸殘基（His41、Glu80、Lys134、Asp108、Glu119）之間形成氫鍵，從而抑制PAN蛋白核酸內切酶活性。如MDCCCL001316苯環上鄰位的兩個羥基氧與兩個錳離子形成配位鍵，其中一個羥基氧與Glu119形成氫鍵，錳離子通過吸電子使底物局部顯正電，配位鍵的產生則減弱了吸電子作用，導致底物不能被降解，從而抑制PAN蛋白核酸內切酶活性。而MDCCCL001302也含有3，4-二羥基苯丙烯基，但是與兩個錳離子形成配位鍵的是羧酸上的羰基氧和羥基氧，同時其苯環上的一個羥基氧與Val121形成氫鍵，錳離子通過吸電子使底物局部顯正電，配位鍵的產生則減弱了吸電子作用，導致底物不能被降解，從而抑制PAN蛋白核酸內切酶活性。

3 討論

本試驗使用的高通量藥物篩選技術是將化學、基因組研究、生物信息，以及自動化儀器等先進技術有機組合在一起，形成的一個高程序、高自動化的新模式，是新藥發現的新程序。高通量篩選技術以微孔板為試驗工具，利用計算機自動化操作系統實時監測、收集試驗數據并對樣品數據進行分析處理，具有微量、靈敏、快速、高效等特點。除了本試驗使用的熒光共振能量轉移（FRET）檢測和熒光淬滅（FQ）檢測外，還有時間分辨熒光（TRET）、熒光偏振（FP）及熒光相關譜（FCS）等檢測手段。本試驗使用FRET和FQ快速從372種化合物中篩選出對PAN有抑制作用的化合物。

默克公司利用藥效團和計算機模擬發現了一類2，4-二氧戊烷丁酮酸系列化合物，例如，DPBA對核酸內切酶的IC50在0.2-29 μmol/L之間；L-742，001是其結構衍生物，不但能夠抑制病毒mRNA的合成，同時還可以有效阻止藥物被移除后流感病毒的再生，細胞試驗發現它是劑量依賴型的抑制劑，是一個較有潛力的候選藥物。對比該系列化合物，本試驗通過高通量藥物篩選得出的3種化合物在分子對接的驗證上，發現了一類3，4-二羥基苯丙烯基的化合物，分別為MDCCCL001302、MDCCCL001315、MDCCCL001316，它們的IC50分別是56 μmol/L，35.5 μmol/L，83.3 μmol/L。這些化合物對PAN蛋白具有明顯的抑制作用，是發現抗流感病毒藥物的先導化合物，需要進行進一步的結構優化。

4 結論

表達純化獲得了流感病毒H5N1的PAN蛋白，通過高通量藥物篩選體系，從372種化合物中篩選出3種對PAN蛋白有抑制作用的化合物，其IC50值分別是56 μmol/L，35.5 μmol/L和83.3 μmol/L。其中3，4-二羥基苯丙烯基在抗流感病毒核酸內切酶活性中具有十分重要的作用。

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（責任編輯 李楠）

High Throughput Drug Screening on Protein PANof Influenza Virus

Zhang Guofang1Li Zhenzhen1Yao Weili2，3Wang Lijun2，4Zhu Xianming5
（1. College of Biology Enginzeering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300222；2. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology & Medicine，Tianjin 300457；3. College of Pharmacy，Nankai University，Tianjin 300071；4. College of Life Science，Nankai University，Tianjin 300071；5. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology & Medicine Company Limited，Tianjin 300457）

PANprotein, which is an endonuclease and highly conserved in influenza virus, is a potential target for the discovery and development of anti-influenza drugs. Three inhibitors of PANprotein were obtained from a compounds library. The molecular docking analysis showed that these compounds can interact with the divalent metal ions and those amino acid residues in the active sites, implying that these components might be the lead compounds for the novel anti-influenza drugs.

Influenza virus Protein PANHigh throughput screening Molecular docking Compounds

2013-07-30

天津市科技支撐計劃國家生物醫藥國際創新園專項（12ZCZDSY13500）

張國防，男，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：guofang.zhang@htmdc.org

朱顯明，男，碩士，助理實驗師，研究方向：生物醫藥；E-mail：xianming.zhu@htmdc.org