微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的初步分離純化

關(guān)靜 孫仁強 宋佳雯 黃迪 成楠 岑院漢鳳 張揚 陳曦樂趙怡姍 朱晨旦 鄭燁 康立 高紅亮

（華東師范大學生命科學學院，上海 200241）

微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的初步分離純化

關(guān)靜 孫仁強 宋佳雯 黃迪 成楠 岑院漢鳳 張揚 陳曦樂趙怡姍 朱晨旦 鄭燁 康立 高紅亮

（華東師范大學生命科學學院，上海 200241）

蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶可以特異性地水解蛋白質(zhì)和多肽的谷氨酰胺殘基，研究了產(chǎn)吲哚金黃桿菌產(chǎn)生的微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的代謝曲線和初步的分離純化。發(fā)酵過程中pH升高，氨濃度增加，到14 h時酶活達到最高為0.359 U/mL。發(fā)酵液離心去上清液經(jīng)3 kD濾膜超濾4倍時，純化倍數(shù)和得率都最高。超濾液加入4倍體積無水乙醇沉淀蛋白質(zhì)，酶的得率最高為72.7%。沉淀用緩沖液復溶后，經(jīng)過SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析分離，得到單一峰。經(jīng)過多步純化后酶得率為31.72%，純化倍數(shù)為124倍，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為單一條帶，分子量約為20 kD。

微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶 超濾 乙醇沉淀 離子交換層析 SDS-PAGE

蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.44）是一種催化水解蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺側(cè)鏈殘基中的酰胺基，并釋放出氨的酶。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶在細胞中廣泛存在，對蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄后的修飾加工過程中起作用，如調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正確折疊，并在蛋白質(zhì)的肽鏈斷裂和蛋白質(zhì)老化等生理過程中也發(fā)揮作用［1］。許多植物種子的蛋白質(zhì)中含有較多的谷氨酰胺殘基，以給種子發(fā)芽提供豐富的氮源，如大豆蛋白、谷物蛋白等。這些植物蛋白在食品工業(yè)中有廣泛的應用，但是蛋白質(zhì)中的高谷氨酰胺含量導致了其在弱酸性環(huán)境中（大多數(shù)食品系統(tǒng)的pH范圍）溶解性很低，限制了其應用范圍。2000年日本學者Yamaguchi［2］發(fā)現(xiàn)了一種由微生物產(chǎn)生的新的脫酰胺基酶，微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。該酶是由從土壤中分離出一株金黃桿菌Chryseobacterium proteolyticum產(chǎn)生的。Yamaguchi等對該酶進行了分離純化和酶學性質(zhì)的研究，其等電點為10，分子量為20 kD左右。該酶僅作用于蛋白質(zhì)或短肽的谷氨酰胺基團，而對天冬酰胺殘基或游離谷氨酰胺沒有影響，不會導致蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)和水解［1］。Yong等［3，4］用該酶分別脫去部分玉米膠蛋白和小麥蛋白的氨基，其溶解性都得到了提高。用蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶脫去植物蛋白中的谷氨酰胺殘基，增加了帶有負電荷的羧基，從而降低了蛋白質(zhì)的等電點，增加了蛋白質(zhì)在弱酸性環(huán)境中的溶解性［1］，同時蛋白質(zhì)的乳化性、發(fā)泡性和凝膠性等都有所增加。因此，在食品行業(yè)蛋白質(zhì)脫氨基作用被認為是一種改善植物蛋白功能特性的好方法［5］。

本實驗室從土壤中篩選出了一株產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes），通過發(fā)酵和活性測定，證明其能夠產(chǎn)生微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶，進一步通過超濾、乙醇沉淀和離子交換層析，初步分離得到蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）華東師范大學微生物實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑 Cbz-Gln-Gly 購自上海西格瑪公司；蛋白含量測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；乙醇、苯酚、硝普鈉等常規(guī)試劑為分析純，購自上海化學試劑公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化純，購自上海生工生物科技有限公司；酵母提取物，購自安琪酵母有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（1 000 mL）蛋白胨10 g，酵母提取物2 g，MgSO4·7H2O 1 g，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（1 000 mL）乳糖5 g，多聚蛋白胨10 g，Na2HPO4·H2O 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO40.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，pH7.2。

1.1.4 主要儀器 冷凍離心機（Thermo electron corporation）；恒溫調(diào)速回旋式搖床（哈爾濱東明醫(yī)療器械廠）；超濾儀（Advanced MidJet Lab System，GE Healthcare）；層析系統(tǒng)（AKTA purify，GE Healthcare）；721分光光度計（上海第三分析儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng) 取0.6 mL 凍存于-80℃的種子接種于30 mL種子培養(yǎng)基，200 r/min 30℃恒溫培養(yǎng)10 h；發(fā)酵培養(yǎng) 取培養(yǎng)好的種子以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min 30℃恒溫培養(yǎng)，期間取樣測定各種參數(shù)。分離純化的發(fā)酵液是培養(yǎng)12 h后的發(fā)酵液。

1.2.2 發(fā)酵液粗酶液的制備 發(fā)酵液8 500 r/min，4℃離心15 min，取上清液為酶的粗提液。

1.2.3 蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的分離純化

1.2.3.1 酶的超濾 以3 kD的濾膜進行超濾。超濾壓力為15 psi，流速為1.67 mL/min。PG酶的分子量約為20 kD［1］，能透過濾膜的為透過液，不能透過的為截留液。

1.2.3.2 乙醇沉淀 以體積比為1∶4（截留液∶無水乙醇）向截留液中緩慢添加無水乙醇（-20℃預冷），-20℃靜置1 h。

1.2.3.3 沉淀復溶 乙醇沉淀后的樣品8 500 r/min，4℃冷凍離心去上清，沉淀用pH6.5的PBS緩沖液復溶。

1.2.3.4 離子交換層析 復溶后的樣品經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后用SP-Sepharose Fast Flow離子交換樹脂進行層析，起始緩沖液為20 mmol/L pH值為6.5的PBS緩沖液，洗脫液為20 mmol/L pH值為6.5的PBS緩沖液中加入1 mol/L NaCl溶液。洗脫速度2 mL/min起始NaCl濃度為0 mol/L，終點NaCl濃度為0.25 mol/L，洗脫10個柱體積，根據(jù)A280來收集含蛋白的吸收峰。

1.2.4 SDS-PAGE電泳 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度10%，分別取80 μL樣品于1 mL離心管中，加入20 μL樣品緩沖液，沸水浴加熱5 min。用微量移液槍加樣，每孔加樣20 μL。

1.2.5 酶活測定方法［2］100 μL底物溶液（含有10 mmol/L Cbz-Gln-Gly和175.6 mmol/L磷酸鈉的緩沖液）與10 μL酶液混合均勻，37℃溫浴30 min，然后加入100 μL 12%的三氯乙酸終止反應。對照反應是先加入三氯乙酸后再加入酶液。18 000 g 離心5 min。上清液中釋放的氨用盧玉棋［6］的方法檢測。酶活單位定義為：上述條件下每分鐘釋放1 μmol氨的量為一個酶活單位。

1.2.6 蛋白含量測定方法 采用碧云天生物技術(shù)有限公司試劑盒，以牛血清白蛋白為標準蛋白，按照說明書的方法進行測定。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶發(fā)酵生產(chǎn)的代謝曲線

試驗首先分析了產(chǎn)吲哚金黃桿菌生長代謝規(guī)律。從圖1可以看出，該菌延滯期較短，接種4 h后進入對數(shù)期，12 h后進入穩(wěn)定期，最終發(fā)酵液OD600可達到2.0。發(fā)酵液的pH值隨著發(fā)酵時間的延長不斷升高，18 h時pH值達到最高8.6。發(fā)酵液中氨增加的趨勢和pH升高的趨勢基本一致，這是因為發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨，氨濃度不斷增加，同時也導致了pH值不斷升高。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的酶活隨著發(fā)酵時間延長而增加，到14 h達到最大0.359 U/mL，隨后酶活略有下降。

2.2 純化條件的優(yōu)化

2.2.1 超濾濃縮倍數(shù)的優(yōu)化 發(fā)酵液離心后，取上清液為粗酶液，用3 kD的超濾膜，以不同的濃縮倍數(shù)對粗酶液進行超濾。由表1可以看出，粗酶液經(jīng)超濾濃縮4倍后，得率、比活和純化倍數(shù)均最高，比活為0.519 U/mg，純化了2.65倍，純化效果最好。因此超濾粗酶液過程中，采取濃縮4倍為最佳條件。

2.2.2 乙醇沉淀比例的優(yōu)化 分別按不同體積比向超濾后的截留液中加入預冷的無水乙醇進行沉淀，以未加入無水乙醇的截留液的相對酶活為100%，相對酶活為沉淀復溶后酶液的總酶活占截留液總酶活的百分比。由圖2可知，當截留液和無水乙醇的體積比為1∶4時，蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的相對酶活最高，為72.73%，表明酶沉淀較為完全，因此1∶4的體積比為最佳沉淀比例。

2.3 離子交換層析

對乙醇沉淀復溶液進行洗脫，隨著NaCl濃度的升高，電導也隨之升高，結(jié)合在層析柱上的蛋白隨之被不斷洗下來，最終得到單一的洗脫峰。蛋白濃度（OD280nm）在第5管收集組分的位置達到最高，為52.12 mAU，與此相對應的第5管收集的酶活也達到最高，為18.03 U/mL（圖3）。在峰尖位置，電導達到7.40 mS/cm。

2.4 PG酶的分離純化結(jié)果

經(jīng)過上述步驟初步分離得到PG酶，由表2可知，純化后的酶，最終得率為31.72%，純化了124.26倍。

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定

粗酶液經(jīng)超濾和乙醇沉淀復溶后的樣品經(jīng)SDSPAGE電泳鑒定，電泳結(jié)果如圖4所示，粗酶液中蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的位置20 kD幾乎沒有條帶，經(jīng)過超濾和乙醇沉淀后，該條帶非常明顯。

離子交換層析樣品到SDS-PAGE圖譜如圖5。穿透峰中有多種蛋白質(zhì)，而在收集峰中20 kD位置明顯的有一個條帶。交換純化后比活為8.843 U/mg。

3 討論

脫氨基是一種提高植物蛋白食品功能性的最有價值的方法之一，脫氨后可以使蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、發(fā)泡性和凝膠性增加［2］，但化學脫氨基法會引起蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，導致蛋白質(zhì)水解而失去功能特性。酶法脫氨比化學法更為理想，底物專一性強，反應條件溫和，而且安全性高。對蛋白質(zhì)脫氨的酶目前報道比較多主要有谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶［7］、蛋白酶［8］、肽谷氨酰胺酶［9］和蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶和蛋白酶的主要酶促反應都不是谷氨酰胺的脫氨基作用，用于植物蛋白脫氨時會有副作用，并給食品帶來不利的影響。肽谷氨酰胺酶雖然可以專一性的脫氨，但是僅以多肽為底物進行反應，對大分子量的蛋白質(zhì)沒有作用［9］。微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶可以專一性的催化蛋白質(zhì)或多肽中的谷氨酰胺殘基脫氨，并且不具有蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性，因此應用前景非常廣泛［1］，并應用于α-玉米蛋白［3］、小麥蛋［4］和大豆蛋白［10］，還有乳清蛋白［11］和脫脂牛奶［12］等。

目前國內(nèi)外對微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的分離純化報道較少，僅有Yamaguchi等［1］報道把Chryseobacterium proteolyticum發(fā)酵上清液超濾，經(jīng)NaCl沉淀，Phenyl-Sepharose疏水層析，Sepcharyl S-100凝膠過濾層析后，酶最終純化了153倍，得率為30%，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為單一條帶。本研究收集產(chǎn)吲哚金黃桿菌的發(fā)酵上清液，經(jīng)過超濾、無水乙醇沉淀、緩沖液復溶后，經(jīng)過SPSepharose Fast Flow離子交換層析分離，得到一個單峰，純化后的酶的得率為31.72%，純化倍數(shù)為124倍。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為單一條帶，分子量約為20 kD，這一研究結(jié)果與Yamaguchi［1］報道相似。Yamaguchi分離純化最后一步通過Sephacryl S-100得到26.2 U/mg，本文最后一步離子交換純化后比活為8.843 U/mg。

4 結(jié)論

通過超濾、無水乙醇沉淀、緩沖液復溶、離子交換層析等步驟，對發(fā)酵液中微生物蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶進行了初步分離純化，最終得到純酶，純化后的酶的得率為31.72%，純化倍數(shù)為124倍。

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（責任編輯 李楠）

Extraction and Purification of Microbial Protein—Glutaminase

Guan Jing Sun Renqiang Song Jiawen Huang Di Cheng Nan Ceng yuan Hanfeng Zhang Yang Chen Xiyue Zhao Yishan Zhu Chendan Zheng Ye Kang Li Gao Hongliang
（School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200241）

Protein glutaminase（PG）is an enzyme that catalyzes the specific hydrolysis of glutaminyl residues in proteins and peptide. The metabolic pattern ofChryseobacterium indologenesin PG synthesis and primary purification of PG were studied. The pH value and ammonia concentration increased during the fermentation. The maximal PG activity reached 0.359 U/mL for 14 hours culture. The efficiency of purification and yield of PG were maximal when culture borth was centrifuged and the supernatant was concentrated for four times by ultrafiltration with 3 kD cut-off membrane. Ultrafiltrate was precipitated by 4 times volumes ethanol and the maximal yield of PG was 72.7%. Precipitated PG by ethanol was dissolved in PBS buffer and further purified by SP-Sepharose Fast Flow ion-exchange chromatography. A single peak was got in elution profile. The final yield of PG was 31.72% and the PG was purified 124 times after multiple purification steps. The purified sample contained a single band in SDS-PAGE and corresponding molecular weight was about 20 kD.

Microbial protein glutaminase Ultrafiltration Ethanol precipitation Ion-exchange chromatography SDS-PAGE

2013-08-01

自然科學基金項目（81072422），國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（1310269039），上海市大學生創(chuàng)新基金項目（KY2012-60S）

關(guān)靜，女，研究方向：食品微生物；E-mail：k378897850@163.com

高紅亮，副教授，研究方向：微生物學，食品化學、食品添加劑；E-mail：hlgao@bio.ecnu.edu.cn