利用不同啟動子控制木糖代謝關鍵酶基因構建可共代謝葡萄糖木糖重組釀酒酵母

金怡 王震 莫春玲 楊秀山 田沈

（首都師范大學 生命科學學院，北京 100048）

利用不同啟動子控制木糖代謝關鍵酶基因構建可共代謝葡萄糖木糖重組釀酒酵母

金怡 王震 莫春玲 楊秀山 田沈

（首都師范大學 生命科學學院，北京 100048）

利用不同強度的啟動子調控木糖代謝關鍵酶活性，構建穩定代謝葡萄糖和木糖產乙醇的重組釀酒酵母。以本實驗室專利菌株Saccharomyces cerevisiaeY5為宿主菌，將樹干畢赤酵母Pichia stipitisCBS6054的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因啟動子（PGKp）控制下，釀酒酵母Y5內源的木酮糖激酶基因XKS1分別由己糖激酶基因啟動子（HXK2p）及其內源啟動子（XKS1p）控制。這3個基因連同各自表達元件導入宿主細胞中，打通其木糖上游代謝途徑。酶活測定結果顯示，HXK2p對木酮糖激酶表現出更強的啟動效率。重組菌Y5-X3-1中木糖還原酶/木糖醇脫氫酶/木酮糖激酶（XR/XDH/ XK）的酶活比值為1∶5∶4，其木糖消耗量是宿主菌的5倍，最高乙醇產量為24.35 g/L，達到理論值的73%。結果表明，通過調節XYL1、XYL2及XKS1啟動子的強度，調控其表達水平，進而改變3種酶的活性水平，對于提高重組釀酒酵母利用木糖發酵產乙醇有明顯效果。

重組釀酒酵母 木糖 乙醇 共發酵 啟動子

以各類農林廢棄物為代表的木質纖維素為原料生產燃料乙醇，具有廣闊的應用前景。木質纖維素類原料中半纖維素組分的有效利用可以使乙醇燃料的生產成本降低25%，這主要歸功于其中的木糖。木糖是自然界中含量僅次于葡萄糖的糖分，木糖的有效利用提高了植物原料生產乙醇的經濟效益，因而對木糖生物轉化的研究是充分開發利用半纖維素的基礎［1］。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工業上生產乙醇的優良菌株，具有許多優秀的生產性能［2］。但釀酒酵母不能有效地利用木質纖維素中含量次豐富的木糖［3］。國內外廣泛采用能天然代謝木糖產乙醇的樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）作為木糖還原酶（XR）和木糖醇脫氫酶（XDH）的基因來源，構建出可以代謝木糖的重組釀酒酵母，但是這些重組菌株發酵木糖能力較弱［4-6］。木酮糖激酶（Xylulokinase，XK）在釀酒酵母體內負責催化木酮糖轉化為5-磷酸木酮糖，處于木糖代謝物進入PPP途徑的關鍵點，是促進木糖代謝向下游進行的關鍵酶。釀酒酵母本身具有該酶，但表達量小。研究表明，表達P.stipitis的XYL1、XYL2并同時超表達自身木酮糖激酶基因（XKS1），可以促進菌株發酵木糖［7，8］。雖然表達XYL1、XYL2和XKS1的重組釀酒酵母可利用木糖發酵，但大多數的木糖都被用來產生木糖醇，乙醇發酵效果并不十分理想［9，10］，無法滿足工業化應用。

目前，國內外構建的重組釀酒酵母無法滿足工業化應用的主要原因之一是XR和XDH的輔酶特異性不同，容易在代謝過程中由于輔酶因子不能及時轉換，導致氧化還原不平衡造成副產物的積累，從而影響乙醇的轉化效率。Eliasson［11］建立在動力學模型基礎上的數據模擬顯示，當XR/XDH/XK值為1∶（≧10）∶（≧4）時，木糖醇的積累最少，乙醇產量最多。因此通過改變啟動子的強度，調節木糖代謝關鍵酶的表達水平，可達到增加乙醇產率，減少木糖醇積累的目的。Matsushika［12］建立了一系列含有由PGKp和ADHp啟動子控制XYL1、XYL2和XKS1的整合質粒的重組工業釀酒酵母。將這3個基因均置于PGKp啟動子下的MR-4重組菌的XR/XDH/ XK值最接近理想比值，為1∶9∶6，其最高乙醇濃度達到15.6 g/L，乙醇得率則達到0.34 g/g，木糖醇產率下降到0.04 g/g。這表明通過調整啟動子的表達強度調控這3個基因的表達水平具有重要的實踐意義。

本實驗室前期已在工業菌株S. cerevisiaeY5中成功表達了來自休哈塔假絲酵母的木糖還原酶（XR）基因，來自熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶（XDH）基因和來自Y5的木酮糖激酶（XK）基因，并建立了一套適用于Y5的轉化體系。重組釀酒酵母在以3%葡萄糖和2%木糖為底物進行厭氧發酵時可在12 h內將葡萄糖消耗殆盡，但木糖利用率較低，最大乙醇產量11.01 g/L、木糖醇產量2.45 g/L［13］。

本研究將來自樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2，置于PGKp強啟動子下，將來自釀酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分別置于己糖激酶啟動子（HXK2p）和其內源的木酮糖激酶啟動子（XKS1p）下。擬將不同啟動子控制下的基因XYL1、XYL2和XKS1導入到發酵性能良好的S.cerevisiaeY5中，以期能夠更加高效穩定發酵葡萄糖和木糖產乙醇的重組酵母菌株的目標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌（Escherichia coli）Top-10、畢赤酵母（Pichia stipitisCBS 6054）、釀酒酵母S.cerevisiaeY5（實驗室專利菌種，專利號：ZL2008-10222897.7）均為本實驗室保存。質粒pDR195、PUC18以及YIp5-kanR也均由本實驗室保存?？寺≥d體pEASY-T1 Simple購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 培養基和培養條件 大腸桿菌及轉化子用 LB培養基培養，使用時可補加100 μg/mL氨卞青霉素作為選擇培養基用于篩選轉化子，37℃靜止或搖瓶振蕩培養。酵母菌用YPD培養基，30℃靜止或搖瓶振蕩培養。

1.1.3 酶、抗生素及試劑 試驗所用限制性內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。分子生物學操作所用試劑盒、Taq DNA聚合酶為天根生化科技（北京）有限公司生產。氨芐抗生素與生化試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司，所用化學試劑為分析純。引物及基因序列的測定均由上海英駿（Invietrogen）生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 整合載體YIp5-XRXDH的構建 分別以表達載體pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2為模板，PCR擴增XYL1和XYL2連同PGKp啟動子和ADH終止子的表達原件X1、X2。再將X1、X2依次連入酵母整合載體YIp5-kanR，構建出重組酵母染色體整合質粒YIp5-XRXDH。

1.2.2 酵母表達載體pXKS1-H和pXKS1-X的構建 以S. cerevisiaeY5基因組為模板，PCR擴增HXK2p啟動子、XKS1p啟動子和木酮糖激酶基因XKS1。YIp5-KanR為模板擴增篩選標記KanR。將HXK2p啟動子連同XKS1基因和ADH終止子的表達原件命名為X3-H；將XKS1p啟動子連同XKS1基因和ADH終止子的表達原件命名為X3-X。將KanR、X3-H及X3-X連入PUC18載體中，分別獲得pXKS1-H和pXKS1-X表達載體。所需引物序列及酶切位點見表1。

1.2.3 重組菌株S. cerevisiaeY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2的構建 將整合質粒YIp5-XRXDH線性化后分別與表達載體pXKS1-H和pXKS1-X通過 LiAc完整細胞轉化法共轉化到S. cerevisiaeY5中，涂布于含G418的YPD培養基上，初步篩選轉化子。采取兩步篩選驗證方法，首先隨機挑取轉化子，提取染色體基因組DNA，進行X1及X2片段的PCR擴增，篩選出YIp5-XRXDH整合成功的陽性轉化子，進入第二步篩選；隨后提取陽性轉化子中質粒，進行X3片段的PCR擴增，進一步篩選出pXKS1-H或pXKS1-X轉化成功的轉化子，分別命名為S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2。

1.2.4 木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）酶活的測定 粗酶液的制備以及木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的酶活測定完全參照文獻［14］進行。用Coomassie Blue法［15］測定蛋白質含量。

1.2.5 重組菌S. cerevisiaeY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2代謝混合糖產乙醇發酵試驗 將待發酵的宿主菌S. cerevisiaeY5和重組菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2分別接種于100 mL YEPD液體培養基中，30℃，150 r/min活化24 h。然后換成新鮮的YEPD液體培養基，于同樣條件下增殖培養24 h，測定其細胞含量（OD600值）。將培養得到的菌液離心，收集沉淀，用0.9% NaCL溶液洗滌沉淀兩次，作為發酵種子液。

將S. cerevisiaeY5、S. cerevisiaeY5-X3-1，S. cerevisiaeY5-X3-2的種子液分別接種到50 mL 1.5%葡萄糖、5%木糖的混合糖培養基中，發酵條件為30℃，150 r/min。發酵起初每隔4 h取樣一次，12 h后每隔12 h取樣一次，取樣量為1 mL，連續取樣120 h。發酵樣品分析葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇濃度。

1.2.6 發酵試驗結果分析方法 糖濃度測定：采用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱Hi-plex H柱，柱溫40℃，檢測器為安捷倫示差檢測器，流動相0.005 mol/L硫酸，流速 0.6 mL/min，進樣量為5 μL。乙醇濃度測定：Agilent7890A氣相色譜儀，色譜柱HJ-PEG-200M為 60 m×0.32 mm×0.5 μm，柱溫為120℃，進樣量為1 μL。

2 結果

2.1 重組酵母整合質粒YIp5-XRXDH構建

構建流程如（圖1）所示，分別以pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2為模板，利用設計的引物進行PCR反應。PCR產物經電泳檢測，發現在2 230 bp、2 250 bp處分別有明顯條帶（圖2）。亞克隆產物測序結果表明，X1和X2與各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白質同源性均達100%，克隆得到的基因X1和X2序列正確。

分別用SphI、NheI雙酶切或EagI、SphI雙酶切亞克隆產物，經瓊脂糖凝膠電泳回收純化獲得X1、X2基因。將X1連接在YIp5-kanR的SphI與NheI位點，將X2連接在YIp5-kanR的EagI與SphI位點，構建出重組酵母染色體整合質粒YIp5-XRXDH。質粒單、雙酶切驗證結果正確（圖3）。

2.2 酵母表達載體pXKS1-H和pXKS1-X的構建

構建流程如圖1所示，以釀酒酵母Y5為模板擴增HXK2p、XKS1p和XKS1基因。以YIp5-kanR為模板擴增kanR篩選標記。分別用EcoR I、BamH I和SalI、NdeI雙酶切pXKS1-H和pXKS1-X，分別切下2 540 bp/4 501 bp、1 702 bp/5 339 bp和2 706 bp/4513、1 702 bp/5 517 bp，質粒構建成功（圖4）。

2.3 工業釀酒酵母S. cerevisiae Y5轉化及轉化子篩選

PCR驗證轉化子染色體基因組DNA及其質粒，結果顯示，S. cerevisiaeY5-X3-1在2230 bp、2250 bp和2920 bp處分別有一個明顯條帶（圖5-A）；同時提取S. cerevisiaeY5-X3-2的染色體基因組DNA及質粒pXKS1-X，PCR驗證（圖5-B）顯示，S. cerevisiaeY5-X3-2在2230 bp、2250 bp和3086 bp處分別有一個明顯條帶。兩株重組菌株均擴增得到大片段X1、X2、X3。亞克隆產物測序結果表明，X1、X2和X3與各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白質同源性均達100%，克隆得到的基因X1、X2和X3序列正確。表明外源目的基因成功導入到酵母中。

2.4 重組釀酒酵母木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶酶活測定

分別測定宿主菌S. cerevisiaeY5及轉化子S. cerevisieY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2粗酶液中木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）的比活力水平，結果（表2）顯示宿主菌株S. cerevi-siaeY5中基本沒有木糖還原酶和木糖醇脫氫酶酶活，木酮糖激酶的酶活水平極低。轉化子S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的比活力分別為宿主菌株的160倍和78倍。說明來源于P. stipitisCBS6054的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2在宿主菌株S. cerevisiaeY5中得到了活性表達。此外，在Y5-X3-1菌株中，HXK2啟動子控制下的XK顯示出相應較高的酶活水平。

2.5 發酵生長曲線的測定

宿主菌和重組菌株的生長曲線（圖6）顯示在混合糖培養基中宿主菌S. cerevisiaeY5及重組菌的生長情況。宿主菌生長緩慢，在120 h測得其最大生長量。兩株重組菌生長狀況相似，且均明顯優于宿主菌，說明異源基因XYL1和XYL2的插入未影響重組菌的生長。另外，S. cerevisiaeY5-X3-1的生長狀況略優于S. cerevisiaeY5-X3-2。

2.6 代謝葡萄糖和木糖限氧共發酵試驗

重組酵母菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2 陽性轉化子及宿主菌S. cerevisiaeY5在限氧條件下進行葡萄糖木糖共發酵搖瓶試驗。HPLC檢測分析發酵底物的消耗和產物的生成（圖7）。

重組菌在4 h內將葡萄糖消耗殆盡后開始利用木糖，且均在120 h內基本將木糖代謝完畢。將木酮糖激酶基因XKS1置于已糖激酶啟動子（HXK2p）的重組菌Y5-X3-1在96 h處測得最大乙醇產量24.37 g/L（圖7-B），而將此基因置于其內源啟動子（XKS1p）的重組菌Y5-X3-2在96 h處測得最大乙醇產量為21.47 g/L（圖7-C）。兩株重組菌的乙醇產率分別達到理論值的76%和67%。宿主菌Y5在混合糖發酵初級階段8 h處測得最大乙醇產量7.40g/L，同一時間點測其葡萄糖消耗完畢，故推斷宿主菌Y5所產乙醇應全為葡萄糖發酵生成。由圖（7-A）可以看出，宿主菌也能利用少量的木糖，并且產生約9.02 g/L木糖醇，一般認為在非特異性還原酶的作用下，釀酒酵母可以消耗少量的木糖。Y5-X3-1和Y5-X3-2的木糖消耗均為宿主菌的5倍，乙醇產量分別是宿主菌的3.3倍和2.9倍。由此說明，木糖代謝關鍵酶基因成功導入釀酒酵母Y5中，并得以成功表達，其木糖代謝上游途徑已打通。

兩株重組菌經120 h發酵，Y5-X3-1在乙醇得率方面較Y5-X3-2增加了16.1%，前者木糖醇最高濃度為10.47 g/L，后者為11.87 g/L，相比下降了13.3%（表3）。

3 討論

國內外構建能利用木糖產乙醇的釀酒酵母普遍采用將天然利用木糖真菌中的XYL1與XYL2基因轉入S. cerevisiae，重組菌株雖能利用木糖，但中間產物木糖醇大量積累，乙醇產量不高。分析原因主要是重組釀酒酵母中表達的XR和XDH所需的輔因子不平衡［16，17］。利用不同啟動子對基因表達可以進行精細調控，使目的基因適度表達，減少由于過量表達引起的細胞內部負擔。

用于大規模乙醇生產的菌株多為耐受乙醇和木質纖維素水解液中抑制物能力較強，染色體組為多倍體的工業釀酒酵母菌株［18-21］。二倍體絮凝菌株S. cerevisiaeY5能夠耐受發酵過程中產生的較高濃度的抑制劑，具有良好的乙醇發酵性能［22，23］。本研究以S. cerevisiaeY5為宿主菌，在引入木糖代謝關鍵酶的同時過表達木酮糖激酶基因，并通過啟動子的不同調節3個酶的酶活比例。

由于己糖激酶基因啟動子（HXK2p）轉錄水平較XKS1基因自身啟動子（XKS1p）較強［18］，因此兩株重組菌酶活顯示Y5-X3-1的木酮糖激酶酶活水平高于Y5-X3-2。對比兩株重組菌，木酮糖激酶酶活較高的Y5-X3-1在混合糖培養基中的生長能力不及Y5-X3-2。Jin 等［19］認為表達過高水平的木酮糖激酶可能會降低細胞內的ATP 水平從而影響菌體的生長。

重組菌Y5-X3-1和Y5-X3-2的XR/XDH/XK比值分別約為1∶5∶4和1∶5∶2。其他相關研究結果表明，當重組菌的XR/XDH/XK比值為1∶（≧10）∶（≧4）時，木糖醇積累最少，乙醇產量最多［11］。Y5-X3-1的XR/XDH/XK比值與理論值最相近，乙醇產量最高。

4 結論

本文將來自樹干畢赤酵母（P.stipitis）的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2置于PGKp強啟動子下,同時將來自釀酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分別置于己糖激酶啟動子（HXK2p）和其內源的木酮糖激酶啟動子（XKS1p）下。通過啟動子的調控，實現XR/XDH/XK三者比值達到1∶5∶4，接近1∶（≧10）∶（≧4）的最優比例，從而降低了副產物木糖醇的積累，提高了乙醇的產率，初步實現了構建更為高效穩定共代謝葡萄糖和木糖產乙醇重組釀酒菌株的目標。

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（責任編輯 李楠）

Construction of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Strains Through Expressing the Key Genes in the Xylose Metabolism Under the Control of Different Promoters for Co-fermentation Glucose and Xylose

Jin Yi Wang Zhen Mo Chunling Yang XiuShan Tian Shen
（College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048）

In order to obtain a recombinant yeast strain which can co-ferment both xylose and glucose, the key genes of enzymes in the xylose metabolism were cloned and transformed intoSaccharomyces. cerevisiaeY5. TheXYL1andXYL2genes fromPichia stipitisCBS6054 were placed under thePGKp, which is a constitutive strong promoter；endogenesisXKS1gene fromS.cerevisiaeY5 was controlled byHXK2pand the native promoterXKS1p, respectively. We measured the activity of XR、XDH and XK and evaluated the xylose-fermenting abilities of the engineered strains. The highest xylulokinase activity was observed in the strain Y5-X3-1 whoseXKS1was controlled byHXK2p. The activity of enzyme ratio was 1∶5∶4 between XR, XDH and XK. Furthermore, the xylose consumption ofS.cerevisiaeY5-X3-1 was 5 times as the host strain during co-fermentation, and the highest ethanol concentration was 24.35 g/L, which correspond to 73% of the theoretical value.

Saccharomyces cerevisiaeXylose Ethanol Co-fermentation Promoter

2013-08-28

北京市教育委員會科技計劃重點項目（KZ201310028034），國家自然科學基金項目（31100578）

金怡，女，碩士研究生，研究方向：微生物酶和發酵工程；E-mail：jinyikele@163.com

田沈，博士，教授，研究方向：微生物與生物質能源轉化；E-mail：cnu_tianshen@sina.com