分子生物學方法在浮游病毒多樣性研究中的應用

高惡斌 王子乾

（江蘇大學環境與安全工程學院，鎮江 212013）

分子生物學方法在浮游病毒多樣性研究中的應用

高惡斌 王子乾

（江蘇大學環境與安全工程學院，鎮江 212013）

病毒是海洋及淡水微生物群落的重要組成部分，在調控微生物環路、驅動生物地球化學循環、維持浮游植物與細菌多樣性等方面扮演著重要角色。然而，傳統的病毒培養及定量技術難以對浮游病毒群落結構與多樣性進行深入而全面的解析。微生物分子生態學技術的快速發展及廣泛應用為此提供了新的途徑。概述了克隆文庫分析方法、凝膠脈沖場電泳（PFGE）技術、DNA指紋圖譜、DNA微陣列、宏基因組技術等分子生物學方法的基本概念及其在研究浮游病毒的種群結構與遺傳多樣性及其與環境因素之間的相互關系等方面的應用狀況。

分子生物學方法 浮游病毒 群落結構 遺傳多樣性

自20世紀80年代以來，研究人員發現病毒廣泛存在于海洋及淡水環境中，構成水生微生物群落的重要組成部分［1，2］，其豐度高于細菌1-2個數量級別，每升水中的數量高達109個病毒粒子［3］。科學家曾推測，如果將海洋中龐大數量的病毒頭尾相連排成一列，則這個隊列的長度將比地球附近的60個星系相互間的距離總和還要長［4］。這一驚人發現使得人們對病毒在水環境中的生態學意義有了重新認識，同時也激發了人們對病毒生態學功能的研究興趣。甚至有科學家認為這一重大發現如果提早若干年，很有可能影響海洋地理及湖沼現代生物學的發展方向［5］。如今，海洋及淡水中的病毒及其在生態系統中的作用是病毒學與生態學研究相互滲透而成的一個新的研究方向，成為水環境科學研究的熱點之一［6，7］。

浮游病毒是一個生態學概念，指懸浮于水體中的各類病毒，包括噬菌體、噬藻體、真核藻病毒和其他動植物病毒等［8，9］。以原核生物為宿主的噬菌體與噬藻體是浮游病毒的主要類群，具有豐富的遺傳多樣性。它們雖然個體極為微小，但十分活躍，是水生態系統結構與功能的重要調控者，在調節水體微生物種群大小、結構與多樣性方面具有顯著作用［10，11］，而且在微生物食物環（Microbial loop）［12］、生物地球化學循環［5］、微生物之間的遺傳物質轉移［13］，以及全球氣候變化［14］等方面起著不可忽視的作用。浮游病毒是引起水生態環境中浮游細胞生物死亡的主要因素之一，對影響微生物群落結構演替與水體初級生產力等起著重要作用［15，16］。特別是對有害藻類細胞的裂解作用，使得病毒在防治有害藻華（赤潮）方面非常具有發展潛力［17，18］。浮游病毒的群落結構及多樣性研究，有助于人們更加深入地認識浮游病毒在水生態系統中的地位與功能及其宿主微生物之間的相互關系，甚至為開發浮游病毒及其基因資源用于改善與保護水生態環境具有重要意義。

對于浮游病毒的研究，最初著重于新病毒的分離鑒定、形態特征、生物學特性以及與宿主相互關系的研究，而關于它們在水體中的種群結構及其與環境因素之間的生態學意義所知甚少。直到20世紀90年代后，隨著微生物分子生態學技術在微生物多樣性及生態功能研究中的廣泛應用，為研究浮游病毒遺傳多樣性提供了新的方法。微生物分子生態學技術涉及生物學、基因組學和生物信息學等學科的理論知識，主要以病毒基因組DNA的序列信息為依據，通過檢測浮游病毒種群DNA序列多態性，鑒定個體的基因型，在基因水平評價種群遺傳分化，并在分子水平上闡述浮游病毒的組成和群落結構及其動態變化，更好地揭示病毒與環境之間的生態學意義。目前，應用于原位環境中浮游病毒種群結構與多樣性研究的微生物分子生態學方法主要包括基于PCR的克隆文庫分析方法、凝膠脈沖場電泳（PFGE）、DNA指紋圖譜、DNA微陣列和宏基因組文庫等。微生物分子生態學技術克服了病毒分離培養的限制，可以在核酸水平上闡明浮游病毒遺傳多樣性及其動態變化，極大了促進了浮游病毒群落結構與生態學功能的研究。

1 克隆文庫

克隆文庫（Cloning library）分析方法是首先從環境樣品中提取出浮游病毒基因組總DNA，利用針對病毒的標記基因序列設計通用引物對樣品總DNA進行PCR擴增，將PCR產物與合適的克隆載體連接，并轉化感受態細胞（大腸桿菌），得到大量含有不同標記基因序列的轉化子，然后對這些轉化子的標記基因序列采用測序技術或PCR/RFLP進行定性分析。對于測得的序列，可以通過與GenBank數據庫中已有數據的對比鑒定其分類地位，或者分析標記基因序列的類型和相對數量，從而得到浮游病毒群落結構和多樣性的信息。

利用克隆文庫分析方法研究浮游病毒多樣性，關鍵是要確定好合適于浮游病毒檢測分析的標記基因。目前，對于浮游病毒體多樣性的研究主要采用病毒的結構蛋白基因g20、DNA聚合酶基因和輔助代謝基因等序列作為其檢測分子遺傳標記。

1.1 結構蛋白基因g20（Structural gene g20）

結構蛋白g20基因（Structural gene g20）是肌尾病毒科中存在的一段編碼結構蛋白基因，其序列相對保守［19］，被作為分子標記用于研究浮游病毒的遺傳多樣性。研究者采用該基因序列作為遺傳標記的研究結果揭示了浮游病毒具有相當豐富遺傳多樣性，而且不同水環境之間遺傳多樣性差異較明顯。Chen等［20］通過針對g20基因序列并構建克隆文庫，研究發現河口與開放海域間藍藻病毒種類組成及結構完全不同，同一位點處不同深度差異較大。Wilhelm等［21］采用此方法分析了聚球藻噬藻體在加拿大Laurentian湖的東、中和西部均有廣泛分布，而且淡水噬藻體與海洋噬藻體的遺傳多樣性有很大的相關性，但是又各成一支，推測其原因是與它們感染的藍藻宿主有關。

1.2 DNA聚合酶基因

DNA聚合酶（DNA Polymerase）是DNA復制所需的一種生化酶，具有高度保守的氨基酸序列，成為研究浮游病毒遺傳多樣性及其親緣關系的重要分子標記。1995年，Short和Suttle［22］首次采用DNA聚合酶基因片段的特異性引物從自然界樣品中直接分離到病毒的pol基因為基礎，揭示了噬藻體和噬菌體的DNA聚合酶基因具有相似性。Labonté等［23］通過DNA聚合酶基因序列發現，加拿大喬治亞灣及墨西哥東北部灣的短尾科病毒分布非常廣泛，且具有豐富的遺傳多樣性。Chen等［24］根據海洋短尾科噬藻體DNA聚合酶基因序列設計兼并引物，對美國切薩皮克海灣夏、冬兩季表層、中層及底層水中的藍細菌短尾病毒的多樣性和動態組成進行研究，揭示該海域短尾科藍藻病毒相當豐富，且病毒種群結構及多樣性呈現出明顯的季節性變化。黃思軍等［25］利用病毒DNA聚合酶基因序列對世界多處采集病毒樣品進行擴增，揭示了全球海洋中藍細菌短尾病毒的廣泛分布。

1.3 輔助代謝基因

輔助代謝基因（Auxiliary metabolic genes，AMGs）是病毒基因組中一類與宿主代謝功能相關的同源基因，在特殊的環境中可有助于提高病毒的生存適應性［26-28］。這類基因序列廣泛存在于藍藻病毒（噬藻體）基因組，且由于不屬于某一特定的病毒科，可作為研究自然環境中藍藻病毒種群結構與遺傳多樣性的分子標記。目前，被作為標靶基因的輔助代謝基因主要有光合作用基因psbA、psbD與焦磷核苷酸水解酶基因mazG，作為研究噬藻體遺傳多樣性及其與宿主藍藻間的相互關系的輔助方法。光合作用基因psbA、psbD分別編碼光系統Ⅱ反應中心的的D1和D2蛋白，是宿主光調控的關鍵基因［29］，其序列具有一定的保守性。Chenard等［30］根據psbA基因序列對海洋及淡水噬藻體的遺傳多樣性進行研究，并構建了系統發育樹，結果發現海洋噬藻體具有不同于淡水噬藻體的進化過程，而且藍藻與噬藻體同屬一進化枝，由此推測噬藻體攜帶的光合基因來源其宿主。mazG是細菌中的焦磷核苷酸水解酶［31］，起到調節營養壓力應激的作用，是細胞程序性死亡的調控子。Bryan等［32］發現mazG基因廣泛存在于以聚球藻為宿主的肌尾病毒科和短尾病毒科噬藻體中，且高度保守。此外，他們利用mazG基因檢測證明了噬藻體呈全球性分布，且不同噬藻體間頻繁進行橫向基因轉移。將輔助代謝基因作為病毒檢測的分子標記，不僅有助于認識環境中浮游病毒種群多樣性，而且可以在功能基因水平上了解病毒與宿主生理狀況的密切聯系。

克隆文庫分析方法只有在分析的克隆數目足夠多的情況下，才可以比較完整地認識種群組成的情況，PCR和克隆策略引入的誤差會對克隆出的標記基因序列及其鑒定產生偏差。由于浮游病毒是高度差異的生物類群，缺少類似于細菌16S RNA的通用分子標記，使得PCR獲得的數據不全面，具有選擇性。此外，克隆文庫分析法成本高，分析時間長，對病毒群落結構變化進行動態跟蹤研究受到很大的限制。

2 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳（Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）是一項依靠有規律地改變電場方向而使大分子DNA得以分離的電泳技術，被廣泛應用于所有的生物基因組結構和功能的研究。由于該技術具有重復性好、分辨力強、易標準化，結果準確穩定，不受表型形狀干擾等優點，被認為是進行分子生物學分型的可信方法之一，其為確定同種生物之間的親緣關系提供了可靠的技術支持。

PFGE技術最初是用于分析羊瘤胃內的噬菌體基因組大小［33］，后來逐漸被用于分析海洋病毒生態學研究［34-37］，并發展成為浮游病毒遺傳多樣性及其種群動力學的重要研究方法。與常規的微生物計數法相比，該技術可以獲得不同水體中浮游病毒的群落結構及多樣性、動態變化、時空分布等特征。目前，PFGE技術已廣泛用于研究不同水體中浮游病毒基因組的大小、豐度及不同基因組大小浮游病毒與環境因素間的相互關系。Wommack等［8］采用PFGE技術對美國切薩皮克灣的浮游病毒種群動力學進行檢測，為期一年的研究結果表明該海灣內的浮游病毒基因組大小范圍在50-300 kb之間，而且浮游病毒群落結構呈現明顯的時空變化。利用PFGE技術，Sandaa與Larsen［38］發現挪威海岸水域中的浮游病毒群落多樣性十分豐富，并呈現明顯的季節性動態變化。劉艷鳴、張奇亞等［39］采用PFGE揭示中國武漢東湖存在5種不同大小的病毒基因組，大小范圍在15-300 kb之間，并證實了噬菌體和噬藻體是構成東湖中浮游病毒群落的優勢類群。Tijdens等［40］揭示了荷蘭Loosdrecht湖浮游病毒基因組大小在30-200 kb之間，并發現了該湖內浮游病毒種群動力學與環境參數密切相關。此外，利用脈沖場凝膠電泳結合DNA指紋圖譜方法對病毒裂解宿主后病毒及其宿主種群結構的變化進行研究，從而證實了病毒是調節水體微生物多樣性的重要因素［41］。近年來，病毒編碼的光合作用基因（psbA、psbD）及其生態學意義成為浮游病毒生態學研究的熱點之一。研究認為病毒的光合作用基因在感染宿主過程中的表達，能夠增強宿主光合能力，對增加病毒的裂解量與自身生存率具有重要作用［42，43］。為了探索自然環境中病毒光合作用基因及其多樣性，Sandaa等［44］利用PFGE方法對挪威海域浮游病毒類群進行分離，再采用病毒光合作用基因引物進行PCR檢測，結果發現PFGE分離的病毒中多數都含有psbA和psbD，兩類病毒只含有psbA，一類病毒只含有psbD。

盡管PFGE是一種快速檢測病毒種群的方法，但該技術僅適于研究環境中浮游病毒群落的整體結構，而對特定類群病毒基因組多樣性的研究還存在一定的不足。此外，對于基因組DNA大小相似的病毒，PFGE很難以有效的將它們區分開來，從而導致對病毒多樣性的檢測結果偏低。

3 DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜（DNA fingerprinting）是用PCR擴增浮游病毒樣品總DNA的標記基因序列，然后用合適的電泳技術將其分離而成的具有特定條帶特征的圖譜。DNA指紋模式的不同就反映種群結構的不同。按分離依據不同，DNA指紋圖譜可分為限制性酶切片段長度多態性圖譜、末端限制性片段長度多態性圖譜、隨機擴增多態性DNA圖譜和變性梯度凝膠電泳圖譜。

3.1 限制性酶切片段長度多態性

限制性酶切片段長度多態性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術是在生物多樣性研究中廣泛應用的DNA分子標記。它的主要技術原理是應用特定的核酸內切限制酶切割有關的DNA分子，經過電泳、原位轉膜印跡、探針雜交、放射性自顯影后，分析與探針互補的DNA片段在長度上的簡單變化。該技術具有全新、快速、高效等優勢，可以在群落水平上提供幾乎無窮盡的、反映遺傳多樣性的可靠證據，可作為一種能高度靈敏檢測自然環境中微生物種群變化的方法。目前已應用于浮游病毒群落結構和動力學研究，以及作為一種鑒定未知病毒的篩選方法。1996年，Chen等［45］利用RFLP技術調查了墨西哥灣近海海域病毒群落的遺傳多樣性，得到了5個不同的系統分類單元（OTUs），均屬于藻DNA病毒科，其中4個屬于寄生藻病毒屬，而另1個OTU在寄生藻病毒屬和金藻病毒屬間形成1個單獨的分支。Marston等［46］利用RFLP技術研究美國羅德洲近海海域噬藻體遺傳多樣性時，鑒定了36種不同肌尾噬藻體的g20基因型，而推測短尾噬藻體與長尾噬藻體是該海域內噬藻體種群的主要成員。

3.2 末端限制性片段長度多態性

末端限制性片段長度多態性（Terminate-restriction length fragment polymorphism，T-RFLP）是RFLP方法的進一步發展，它是利用一定的標記引物對樣品中的DNA進行特異擴增，在計算機程序自動分析時僅分析熒光標記的末端限制片段，這樣使得限制片段長度多態性圖譜更為簡化，并且每個可見的條帶都代表一個“核型”或一個分類單元。此法能夠得到一個群落的特征指紋圖譜，可用于比較不同群落的相似性以及群落結構在時間和空間上的動態變化。Jiang等［47］利用T-RFLP技術調查研究了加利福尼亞南部海域的噬菌體遺傳多樣性，并鑒定了30種不同的基因組RFLP帶型，表明病毒多樣性遠比其宿主的多樣性要豐富，而且感染相同或相似宿主的噬菌體遺傳學組成相似。他們還發現此海域的病毒基因組大小在40 kb-200 kb之間，并且呈垂直分布狀態，上層水域的病毒要比下層豐富。此外，Sobecky等［48］采用此方法發現水生態系統中病毒參與的水平基因轉移現象，而病毒介導的水平基因轉移是造成群落多樣性的一個重要原因。2004年，Wang等［49］研究美國切薩皮克灣噬藻體的遺傳多樣性與種群動力學時，鑒別出許多新的g20序列，在15個g20序列中只有一個與已分離的噬藻體相近，而且T-RFLP圖譜分析表明該海灣中噬藻體的種群結構及多樣性受季節性變化影響比空間變化影響更加明顯。通過采用T-RFLP技術，Labonté等［23］在加拿大喬治亞灣及墨西哥東北部灣得到了與短尾病毒相關的29個不同系統分類單元（OTUs），汪岷與閆群等［50］在我國青島近海春季水樣中共獲得11個病毒OTUs，并通過構建系統樹的方法發現這11個OTUs聚成了3簇。

3.3 隨機擴增多態性DNA

隨機擴增多態性DNA（Randomly amplified poly-morphic DNA，RAPD）由Williams建立的［51］，是利用隨意設計的長度為8-10 bp的非特異引物，在不嚴格的PCR條件下（低退火溫度）對基因組DNA隨機擴增，獲得一系列大小不同的產物，通過電泳而產生了由一系列條帶組成的指紋圖譜。該技術克服了RFLP方法的局限性，不需了解DNA序列，具有操作簡便、快速和經濟等優點，在環境微生物生態學研究中得到了廣泛應用。Winget等［52］采用RAPD-PCR評估Chesapeake海灣中浮游病毒群落的豐富度動態變化，揭示了浮游病毒時間變化要比空間變化更加明顯。相比其他檢測技術，RAPD-PCR在研究浮游病毒多樣性時顯得更加實用有效。

3.4 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）方法是最先用于檢測DNA突變的一種電泳技術［53］。它主要是通過在一般聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎上添加了呈梯度分布的化學變性劑（如尿素和甲酰胺），使核苷酸序列不同分子相近的DNA片段沿著化學梯度的差異而滯留于凝膠的不同位置，從而形成相互分開的圖譜，該圖譜可以看成是微生物群落中主要種類的一個輪廓。該技術具有可重復和容易操作等特點，能夠提供微生物群落中優勢種類信息和同時分析多個樣品，適合于調查種群的時空變化、種群成員鑒定。

該方法往往結合PCR同時使用，首先利用針對標記基因序列的特異引物進行PCR擴增，然后利用DGGE把不同的堿基組成的序列分開，按照條帶位置的不同割取相應條帶測序，進而分析病毒的多樣性和動態變化。DGGE結合PCR方法已成為揭示自然環境中浮游病毒群落結構、遺傳多樣性及種群動態分析的有效手段。1999年，Short和Suttle針對藻類病毒特異性DNA多聚酶（pol）基因片段進行PCR引物擴增，通過DGGE技術分離PCR擴增片段并對不同片段進行克隆測序分析［54］，從而得知自然海洋水中不同位置藻病毒群落的遺傳多樣性。2005年，他們再次采用同樣的方法分析了海洋環境中噬藻體群落的遺傳多樣性［55］，并初步證實了噬藻體與宿主間的依賴關系以及它們在地理分布上并無直接聯系的進化特點。Wilson等［56］采用該技術方法對福克蘭群島到英聯合王國的大西洋橫斷面噬藻體多樣性空間分布進行研究，揭示了噬藻體的遺傳多樣性及結構組成還與水體分層密切相關。Schroeder等［57］采用此方法分析了球石藻赤潮前后海洋病毒的多樣性與種群動力學，得出浮游病毒種群多樣性發生了改變，Dorigo等［58］采用此方法研究法國Bourget淡水湖中噬藻體多樣性及其與環境因素相互關系。最近，Chénard與Suttle［59］利用PCR-DGGE技術對淡水和海洋噬藻體psbA基因片段進行分析，結果揭示了淡水噬藻體與海洋噬藻體的psbA基因有不同的進化史，同一地理區域的噬藻體psbA基因結構也存有差異。

4 核酸探針檢測技術

核酸探針檢測技術（Nucleic acid probe technology）是根據堿基互補配對的原則，被標記的特異性核苷酸探針（用放射性元素或熒光染料標記）以原位雜交、Southern印跡雜交、斑點印跡和狹線印跡雜交等不同方法，可直接用來檢測待測樣品中的同源核酸序列，從而獲得DNA序列及片段長度多態性。由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的高度靈敏性，使得核酸分子雜交技術廣泛應用于微生物多樣性的研究中，定性定量分析它們的存在、分布和豐度。近年來，此方法被用于水環境中的病毒群落的檢測與生態作用研究。Wommack等［60］采用核酸雜交技術分析了Chesapeake海灣中浮游病毒群落的時空動力學及其宿主生物之間的相互關系，結果發現病毒在時間與空間上發生顯著的豐度變化，并且是導致細菌與浮游植物群落遺傳多樣性的重要因素。

該技術所采用的探針必須是已知的病毒序列，其檢測結果只是已知的病毒，得不到新的病毒基因。目前，NCBI數據庫里的病毒序列信息非常有限，難以獲得較為全面的病毒檢測探針，因而在分析浮游病毒多樣性時獲得的相關信息比較少。

5 DNA微陣列

DNA微陣列（DNA chip）也稱為基因芯片（G-eochip），是20世紀90年代中期發展起來的一門新技術，它是采用原位合成或直接點樣的方法，將成千上萬個基因有序的排列在固體載體上而形成微矩陣，待檢測樣品用熒光分子標記后，與微陣列雜交，通過熒光掃描及計算機分析即可獲得樣品中大量基因的表達類型、突變情況及不同基因的組成與變化情況，以達到快速、高效、高通量的分析生物信息的目的。

DNA微陣列應用于病毒多樣性研究主要是從球石藻病毒的全基因組測序開始，Allen等［61］以球石藻病毒EhV-86全基因組序列為基礎設計探針并構建EhV-86的DNA微陣列，從基因水平上評估球石藻病毒屬的多樣性，也從轉錄水平調查球石藻病毒的感染過程。然后他們利用標記基因、宿主范圍和微陣列從基因型到表型上去探討球石藻病毒的株間多樣性，通過微陣列結果發現以前認為是相同的兩個病毒株實際上存在較大差異［62］。以往基于PCR方法的單個基因研究，可以獲得浮游病毒遺傳多樣性的相關信息，而在確定屬內病毒間的遺傳距離時受到限制，應用DNA微陣列分析病毒屬內的多樣性，可以很好地解決系統發生關系。DNA微陣列分析能檢測同源基因差異性，提供影響生物多樣性的重要信息，但僅限制于用已知病毒基因做探針，在分析中得不到新的基因。

6 宏基因組文庫（Metagenomics library）

宏基因組的概念是由Handelsman等于1998年首先提出的，也稱為環境基因組，其定義是指特定生境中全部微小生物遺傳物質的總和［63］。與傳統方法相比，宏基因組技術主要利用非人工培養的分子生物學技術、方法和手段進行系統分析微生物在環境中的基因組集合，研究其群落結構與生態功能。宏基因組學研究的基本思路是直接提取環境中特定微生物群落的基因組總DNA，克隆到合適的載體，轉化宿主細胞，形成一個高度復雜的重組DNA文庫，從文庫中獲得相關基因，避免了傳統微生物學基于分離培養研究的限制。

近年來，宏基因組學研究極大的推動了環境微生物生態學的發展，為充分認識自然環境中浮游病毒群落的遺傳組成及其多樣性開辟了新的研究途徑。2002年，Breitbart等［64］利用宏基因組學技術對2個天然海水水體中的病毒群體進行研究，開啟了宏基因組學在浮游病毒研究領域的應用。Breitbart等［65］運用宏基因組學結合數學模型的方法，推算1 kg的近海表層沉積物中的病毒種類將超過地球上所有的爬行動物種類的總和。Angly等［66］運用宏基因組學技術對北大洋、墨西哥灣、馬尾藻海域和哥倫比亞海域的病毒群體進行了研究，探討了海洋病毒群落的結構組成及及其分布狀況，并發現雙鏈DNA病毒可能是生物圈中遺傳多樣性的最豐富的群體之一。宏基因組學不僅可以提供自然環境中浮游病毒的群落結構及多樣性數據，而且可以提供一些潛在的病毒種群結構數據。Bench等［67］構建了切薩皮克灣浮游病毒宏基因組文庫，并發現大量的未知病毒和新病毒序列。Ngando等［68］利用宏基因組技術對Senegal的一個超鹽湖進行了病毒多樣性研究，并發現了許多的序列與SEED數據庫不匹配（SEED是由GenBank數據庫和已測的所有基因組序列組成的數據庫）。2009年，Sharon等［69］通過已經獲得的環境病毒宏基因組文庫進行比較分析，發現了一系列與光系統I（PSI）相關的基因序列，并揭示了這些基因在噬藻體基因組中普遍存在。

利用宏基因組技術研究浮游病毒遺傳多樣性時，克服了浮游病毒沒有統一分子標記的不足，能夠獲得比較全面可靠的數據。在宏基因組技術的應用中，應加強與其他技術相結合，以減少單一技術造成的偏差。對特定環境內的浮游病毒群落多樣性進行研究時，宏基因組文庫技術可避免PCR偏好性所導致的誤差，而PCR文庫可矯正構建宏基因組文庫的基因遺漏現象。因而，采用宏基因組文庫結合PCR文庫的分析方法，將會有助于不同環境中的病毒群落結構與遺傳多樣性的精確研究。

7 結語

分子生物學技術在浮游病毒生態學研究中已顯現其獨特的優越性，成為一種快速分析浮游病毒群落組成結構與多樣性的有效手段。在分析浮游病毒多樣性的過程中，通過采取多種分子生物學技術方法結合使用，取長補短，相互補充，可以減少單一分析技術的局限性，綜合各類技術的優勢，使獲得的浮游病毒生態學信息更為客觀、真實和有效。

［1］ Bettarel Y, Sime-Ngando T, Amblard C, Dolan J. Viral activity in two contrasting lake ecosystems［J］. Appl Environ Microbiol, 2004, 70：2941-2951.

［2］ Suttle CA. Viruses in the sea［J］. Nature, 2005, 437：365-361.

［3］ Bergh O, Borsheim KY, Bratbak G. High abundance of viruses found in aquatic environments［J］. Nature, 1989, 340：467-468.

［4］ Suttle CA. Marine viruses—Major players in the global ecosystem［J］. Nat Rev Microbiol, 2007, 5：801-812.

［5］ Fuhrman JA. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects［J］. Nature, 1999, 399：541-548.

［6］ 張奇亞, 桂建芳.一類不可忽視的站略生物資源——淡水與海水中的病毒及其在生態系統中的作用［J］. 中國科學院院刊, 2009, 24：414-420.

［7］ 焦念志. 海洋微型生物生態學［M］. 北京：科學出版社, 2006. 272-303.

［8］ Wommack KE, Ravel J, Hill RT. Population dynamics of chesapeake bay virioplankton：total community analysis by pulsed-field gel electrophoresis［J］. Appl Environ Microbiol, 1999, 65：231-240.

［9］ Weinbauer MG. Ecology of prokaryotic viruses［J］. FEMS Microbiol Rev, 2004, 28：127-181.

［10］ Wilhelm SW, Suttle CA. Viruses and nutrient cycles in the sea［J］. Bio Science, 1999, 49：781-788.

［11］ Weinbauer MG, Rassoulzadegan F. Are viruses driving microbial diversification and diversity?［J］. Environmental Microbiology, 2003, 6：1-11.

［12］ Wilhelm SW, Suttle CA. Viruses and nutrient cycles in the sea—viruses play critical roles in the structure and function of aquatic food webs［J］. Bioscience, 1999, 49：781-788.

［13］ Chiura HX. Generalized gene transfer by virus-like particles from marine bacteria［J］. Aquat Microb Ecol, 1997, 13：75-83.

［14］ Hill RW, White BA, Cottell MT, et al. Virus-mediated total release of dimethysulfoniopropionate from marine phytoplankton：a potential climate process［J］. Aquat Microb Ecol, 1998, 14：1-6.

［15］ Wommack KE, Colwell RR. Virioplankton：Viruses in aquatic ecosystems［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 2000, 64：69-114.

［16］ Brussaard CP. Viral control of phytoplankton populations—a review［J］. J Eukaryot Microbiol, 2004, 51：125-138.

［17］ Bratbak G, Egge JK, Heldal M, et al. Viral mortality of the marine alga Emiliania huxleyi（Haptophyceae）and termination of algal blooms［J］. Mar Ecol Prog Ser, 1993, 93：39-48.

［18］ Gao EB, Yuan XP, Li RH, Zhang QY. Isolation of a novel cyanophage infectious to filamentous cyanobacterium Planktothrix agardhii（Cyanophyceae）from Lake Donghu in China［J］. Aquat Microb Ecol, 2009, 54：163-170.

［19］ Fuller NJ, Wilson WH, Joint IR, et al. Occurrence of a sequence in marine cyanophages similar to that of T4 g20 and its application to PCR-based detection and quantification techniques［J］. Appl Environ Microbiol, 1998, 64：205-2060.

［20］ Zhong Y, Chen F, Wilhelm SW, et al. Phylogenetic diversity of marine cyanophage isolates and natural virus communities as revealed by sequences of viral capsid assembly protein gene g20［J］. Appl Environ Microbiol, 2002, 68：1576-1584.

［21］ Wilhelm SW, Carberry MJ, Eldridge ML, et al. Marine and freshwater cyanophages in a laurentian great lake：evidence from infectivity assays and molecular analyses of g20 genes［J］. Appl Environ Microbiol, 2006, 72：4957-4963.

［22］ Short SM, Suttle CA. Use of polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis to study diversity in natural virus communities［J］. Hydrobiologia, 1999, 401：19-32.

［23］ Labonté JM, Reid KE, Suttle CA. Phylogenetic analysis indicates evolutionary diversity and environmental segregation of marine podovirus DNA polymerase gene sequences［J］. Appl Environ Microbiol, 2009, 75：3634-3640.

［24］ Chen F, Wang K, Huang S, et al. Diverse and dynamic populations of cyanobacterial podoviruses in the Chesapeake Bay unveiled through DNA polymerase gene sequences［J］. Environ Microbiol, 2009, 11：2884-2892.

［25］ Huang S, Wilhelm SW, Jiao N, et al. Ubiquitous cyanobacterial podoviruses in the global oceans unveiled through viral DNA polymerase gene sequences［J］. The ISME Journal, 2010, 4：1243-1251.

［26］ Sullivan MB, Coleman ML, Weigele P, et al. Three Prochlorococcus cyanophage genomes：Signature features and ecological interpretations［J］. PLoS Biol, 2005, 3：e144.

［27］ Breitbart M, Thompson LR, Suttle CA, Sullivan MB. Exploring the vast diversity of marine viruses［J］. Oceanography, 2007, 20：135-139.

［28］ Thompson LR, Zeng QL, Kelly L, et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbonmetabolism［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 108：757-764.

［29］ Alperovitch-Lavy A, Sharon I, Rohwer F, et al. Reconstructing a puzzle：existence of cyanophages containing both photosystem-I and photosystem-II gene suites inferred from oceanic metagenomic datasets［J］. Environ Microbiol, 2011, 13：24-32.

［30］ Chénard C, Suttle CA. Phylogenetic diversity of sequences of cyanophage photosynthetic gene psbA in marine and freshwaters［J］. Appl Environ Microbiol, 2008, 74：5317-5324.

［31］ Gross M, Marianovsky I, Glaser G. MazG-a regulator of programmed cell death in Escherichia coli［J］. Molecular Microbiology, 2006, 59：590-601.

［32］ Bryan MJ, Burroughs NJ, Spence EM, et al. Evidence for the intense exchange of MazG in marine cyanophages by horizontal gene transfer［J］. PLoS ONE, 2008, 3：1-12.

［33］ Klieve AV, Swain RA. Estimation of ruminal bacteriophage numbers by pulsed-field gel electrophoresis and laser densitometry［J］. Appl Environ Microbiol, 1993, 59：2299-2303.

［34］ Castberg T, Larsen A, Brussaard C, et al. Microbial population dynamics and diversity during blooms of the marine coccolithophorid Emiliania huxleyi（Haptophyta）［J］. Mar Ecol Prog Ser, 2001, 221：39-46.

［35］ Jiang S, Fu W, Fuhrman JA. The vertical distribution and diversity of marine bacteriophages at a station off Southern California［J］. Microb Ecol, 2003, 45：399-410.

［36］ Larsen A, Castberg T, Sandaa RA, et al. Population dynamics and diversity of phytoplankton, bacteria and virus in a seawater enclosure［J］. Mar Ecol Prog Ser, 2001, 221：47-57.

［37］ Larsen A, Fonnes GA, Sandaa RA, et al. Spring phytoplankton bloom in Norwegian coastal waters：microbial community dynamics, succession and diversity［J］. Limnol Oceanogr, 2004, 49：180-190.

［38］ Sandaa RA, Larsen A. Seasonal variations in virus-host populations in Norwegian coastal waters-focusing on the cyanophage community infecting marine Synechococcus spp［J］. Appl Environ Microbiol, 2006, 72：4610-4618.

［39］ 劉艷鳴, 張奇亞, 袁秀平. 利用脈沖場凝膠電泳測定東湖浮游病毒基因組的大小［J］. 武漢大學學報：理學版, 2005（S2）：238-240.

［40］ Tijdens M, Hoogveld HL, Kamst-van Agterveld MP, et al. Population dynamics and diversity of viruses, bacteria and phytoplankton in a shallow eutrophic lake［J］. Microb Ecol, 2008, 56：29-42.

［41］ Steward GF, Montiel JL, Azam F. Genome size distributions indicate variability and similarities among marine viral assemblages from diverse environments［J］. Limnol Oceanography, 2000, 45：1697-1706.

［42］ Lindell D, Jaffe JD, Coleman ML, et al. Genome-wide expression dynamics of a marine virus and host reveal features of coevolution［J］. Nature, 2007, 449：83-86.

［43］ Lindell D, Jaffe JD, Johnson ZI, et al. Photosynthesis genes in marine viruses yield proteins during host infection［J］. Nature, 2005, 438：86-89.

［44］ Sandaa RA, Clokie M, Mann NH. Photosynthetic genes in viral populations with a large genomic size range from Norwegian coastal waters［J］. Federation of European Microbiological Societies Microb Ecol, 2008, 63：2-11.

［45］ Chen F, Suttle CA, Short SM. Genetic diversity in marine algal virus communities as revealed by sequence analysis of DNA polymerase genes［J］. Appl Environ Microbiol, 1996, 62：2869-2874.

［46］ Marston MF, Sallee JL. Genetic civersity and temporal variation in the cyanophage community infecting marine synechococcus species in Rhode island’s coastal waters［J］. Appl Environ Microbiol, 2003, 69：4639-4647.

［47］ Jiang S, Fu W, Chu W, et al. The vertical distribution and diversity of marine bacteriophage at a station off southern California［J］. Microbial Ecology, 2003, 45：399-410.

［48］ Sobecky PA, Hazen TH. Horizontal gene transfer and mobile genetic elements in marine systems［J］. Methods in Molecular Biology, 2009, 532：435-453.

［49］ Wang K, Chen F. Genetic diversity and population dynamics of cyanophage communities in the Chesapeake Bay［J］. Aquat Microb Ecol, 2004, 34：105-116.

［50］ 汪岷, 閆群 噬藻體遺傳多樣性的研究進展［J］. 中國海洋大學學報：自然科學版, 2010（8）：73-79.

［51］ Williams JG, Kubelik KAR, Livak KJ, et al. DNA Polymorphisms amplified by arbitray primers are useful as genetic markers［J］. Nucl Acid Res, 1990, 18：6531-6535.

［52］ Winget DM, Wommack KE. Randomly amplified polymorphic DNA PCR as a tool for assessment of marine viral richness［J］. Appl Environ Microbiol, 2008, 74：2612-2618.

［53］ Muyzer G, DeWaal EC, Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16SrRNA［J］. Appl Environ Microbiol, 1993, 59：695-700.

［54］ Short SM, Suttle CA. Sequence analysis of marine virus communities reveals that group s of related algal viruses are widely distributed in nature［J］. Appl Environ Microbiol, 2002, 68：1290-1296.

［55］ Short CM, Suttle CA. Nearly identical bacteriophage structural gene sequences are widely distributed in both marine and freshwater environments［J］. Appl Environ Microbiol, 2005, 71：480-486.

［56］ Wilson WH, Fuller NJ, Joint IR, et al. Analysis of cyanophage diversity in the marine environment using denaturing gradient gel electrophoresis［C］// Bell R, Brylinsky M, Johnson-Green P（ed.）, Microbial biosystems：new frontier. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology, Halifax, Nova Scotia, Canada：Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, 2000：565-570.

［57］ Schroeder DC, Oke J, Hall M, et al. Virus succession observed during an Emiliania huxleyi bloom［J］. Appl Environ Microbiol, 2003, 69：2484-2490.

［58］ Dorigo U, Stecphan J, Humbert JF. Cyanophage diversity, inferred from g20 gene analyses, in the largest natural lake in france, lake bourget［J］. Appl Environ Microbiol, 2004, 70：1017-1022.

［59］ Chénard C, Suttle CA. Phylogenetic diversity of sequences of cyanophage photosynthetic gene psbA in marine and freshwaters［J］. Appl Environ Microbiol, 2008, 74：5317-5324.

［60］ Wommack KE, Ravel J, Hill RT, et al. Hybridization analysis of chesapeake bay virioplankton［J］. Appl Environ Microbiol, 1999, 65：241-250.

［61］ Allen MJ, Wilson WH. The coccolithovirus microarray：an array of uses［J］. Briefings In Functional Genomics And Proteomics, 2006, 5：273-279.

［62］ Allen MJ, Martinez J, Schroeder DC, et al. Use of microarrays to assess viral diversity from genotype to phenotype［J］. Environ Microbiol, 2007, 9：971-982.

［63］ Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products［J］. Chem Biol, 1998, 5：245-249.

［64］ Breitbart M, Salamon P, Andresen B, et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99：14250-14255.

［65］ Breitbart M, Felts B, Kelley S, et al. Diversity and population structure of a nearshore marine sediment viral community［J］. Proc Biol Sci, 2004, 271：565-574.

［66］ Angly FE, Felts B, Breitbart M, et al. The marine viromes of four oceanic regions［J］. Plos Biol, 2006, 4：2121-2131.

［67］ Bench SR, Hanson TE, Williamson KE, et al. Metagenomic characterization of chesapeake bay virioplankton［J］. Appl Environ Microbiol, 2007, 73：7629-7641.

［68］ Sime-Ngando T, Lucas S, Robin A, et al. Diversity of virus- host systems in hypersaline Lake Retba, Senegal［J］. Environ Microbiol, 2011, 13：1956-1972.

［69］ Sharon I, Alperovitch A, Rohwer F, et al. Photosystem I gene cassettes are present in marine virus genomes［J］. Nature, 2009, 461：258-262.

（責任編輯 狄艷紅）

Application of Molecular Biological Methods to Research on the Genetic Diversities of Virioplankton

Gao Ebin Wang Ziqian
（School of the Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

Viruses are recognized as an important component of aquatic microbial communities in marine and freshwater environments, and play a significant role in regulating microbial loop, driving global biogeochemical cycling and maintaining clonal diversities of phytoplankton and bacterioplankton populations. However, the structure and diversity of virioplankton communities have not been extensively and overall investigated using classical viral culture and quantitative methods, and the rapid development and application of molecular-ecological techniques offer a new way. The basic concept of some molecular biological methods including cloning library, PFGE, DNA fingerprinting, DNA chip and metagonemics were described, and their application to address the population composition and genetic diversities of virioplankton in natural aquatic environment, and to investigate the ecological relationship between virioplankton and environmental factors.

Molecular biological method Virioplankton Community structure Genetic diversity

2013-09-16

國家自然科學基金項目（31200019），江蘇大學高級專業人才啟動基金（11JDG151），中國博士后科學基金（20110491363）

高惡斌，男，博士，研究方向：微生物分子生態學；E-mail: gaofei7908@126.com