環介導等溫擴增技術在轉基因水稻Bt63檢測中的應用

張明哲陳曦徐俊鋒陳吳健吳蓉吳志毅

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，杭州 310016；2.浙江省農業科學研究院，杭州 310021；3.杭州出入境檢驗檢疫局，杭州 310012）

環介導等溫擴增技術在轉基因水稻Bt63檢測中的應用

張明哲1陳曦1徐俊鋒2陳吳健1吳蓉3吳志毅1

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，杭州 310016；2.浙江省農業科學研究院，杭州 310021；3.杭州出入境檢驗檢疫局，杭州 310012）

采用環介導等溫擴增技術（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）對轉基因水稻Bt63進行應用檢測。研究表明，環介導等溫擴增技術檢測轉基因水稻Bt63特異性好，并且靈敏度達到0.01%（W/W），具有簡便、快速、準確等特點，可以在進出口檢驗檢疫、食品安全監測等領域進行應用。

環介導等溫擴增技術 轉基因水稻Bt63 檢測

近年來，世界上轉基因生物研發工作進展非常迅速，2012年全球轉基因作物種植面積達到1.703× 108hm2，比2011年的1.6×108hm2增長了6%，較1996年增長了100倍［1］。隨著轉基因作物已被快速、持續地用于商業化生產，無論在發達國家還是發展中國家都產生了巨大的經濟、能源、衛生及社會效益。但同時，轉基因作物及其產品可能帶來的環境、健康等問題也已引起世界性的所謂“生物安全”的論戰。為此，許多國家相繼制定了對轉基因生物的管理法規，對進口轉基因食品進行嚴格管理，要求出具轉基因成分的檢測報告，對轉基因食品采用標識制度。我國于2001年5月23日頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》，2001年9月5日開始實施《出入境轉基因產品檢驗檢疫管理辦法》，2002年3月20日開始貫徹實行《農業轉基因生物標識管理辦法》。

隨著各個國家對農業轉基因生物實行檢驗檢疫和標識制度管理的加強，轉基因檢測的對象已經從原來的大豆、小麥、大米、土豆等農產品擴展到許多深加工的產品，如食用油脂、米制品、醬油、豆奶、酒、飼料等等，而這其中米制品一直是歐盟和其他一些國家關注的重點。2006年9月以來，已有法國、德國、意大利、奧地利和日本等7個國家因為轉基因大米污染對我國出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施。歐盟在2008年4月15日起對中國出口的大米及其米制品采取保障性措施，要求由中方認可的實驗室對出口產品實施檢測，并出具統一的衛生證書才能出口。而另一方面，我國對轉基因作物培育的投入也逐年增加，近年來具有良好生長性能的轉基因新品種不斷涌現，2009年農業部審放了轉基因耐除草劑水稻“Bt汕優63”等三個轉基因農作物的生產應用安全證書，這標志著我國極有可能成為世界上第一個商業化種植轉基因水稻的國家，因此如何快速便捷的檢測轉基因水稻已成為了當前熱門的研究課題之一。

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由Notomi 等［2］發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上6個區域的4條引物（2 條外引物，2 條內引物）及具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，在65℃左右進行核酸的指數級擴增，其擴增效率可達到109-1010個拷貝數量級。LAMP反應步驟可分為2個部分—啞鈴狀模板構造的形成（圖1-A）與循環擴增（圖1-B）。如圖1-A所示，在65℃左右時，FIP引物在Bst酶作用下以F2 區段的3'末端為起點，與模板DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前端F3c序列互補，以3'末端為起點，通過鏈置換型DNA聚合酶的作用，一邊置換先頭FIP 引物合成的DNA鏈，一邊合成自身DNA，如此向前延伸。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產生一單鏈，這條單鏈在5'末端存在互補的F1c和F1區段，于是發生自我堿基配對，形成單邊環狀結構。同時這條單鏈DNA，又可作為模板，在另一端結合BIP引物和B3引物合成一條雙鏈，并置換出一條單鏈DNA。此時，被置換的單鏈DNA兩端都存在互補序列，自我堿基配對后整條鏈呈現啞鈴狀構造（圖1-A）。上述過程中最后形成的啞鈴狀模板構造是循環反應的原料（圖1-B）。在循環反應中，首先在啞鈴狀結構中，以3'末端的F1區段為起點，以自身為模板，進行DNA 合成延伸。與此同時，FIP 引物F2 與環上單鏈F2c 雜交，啟動新一輪鏈置換反應。解離由F1 區段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。在環狀結構上存在單鏈形式B2c，BIP 引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增。最終形成如花椰菜樣的莖-環結構DNA組成的混合物，即由在同一條鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構。整個反應僅需1 h，具有簡便、快速、準確等特點。LAMP法廣泛應用于包括病毒［3-5］、細菌［6-8］等傳染性疾病的定性和定量檢測。近年來，該技術逐漸開始用于轉基因作物檢測領域，如柳毅等［9］用于檢測轉基因大豆，張雋等［10］檢測轉基因玉米MON863，以及凌莉等［11］檢測轉基因玉米MIR602等一些報道，但用于轉基因水稻檢測的應用較少，本研究就是準備采用LAMP法對轉基因水稻Bt63進行快速檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 轉基因樣品 轉基因水稻品系Bt汕優63（簡稱Bt63）、科豐6號（KF6）、克螟稻（KMD1）為浙江省農業科學研究院饋贈；轉基因玉米品系Bt176，轉基因大豆品系GTS-40-3-2，轉基因油菜籽品系GT73均購自歐洲標準局（IRMM）；非轉基因水稻則購自國內市場。

1.1.2 材料制備 將轉基因水稻Bt 63研磨（PHILIPS cucina blender HR2860）至粉末狀（0.2 mm左右），并按表1比例混合轉基因和非轉基因的材料，分別獲得50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%和0.001%含量的轉基因樣品。

1.1.3 儀器 OptiGene Limited GenieⅡ等溫擴增檢測系統（英國OptiGenie Limited 公司）；Sorvall micro21R臺式冷凍離心機（Thermo）；數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；XS104 電子天平（Mettler Toledo）；Nano Drop 3300核酸測定儀（Thermo）；Milli-Q 超純水系統（Millipore）等。

1.1.4 試劑 DNA提取試劑盒為QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒；引物由寶生物工程（大連）有限公司（TAKARA）合成；擴增試劑來自于英國OptiGenie Limited 公司，熒光顯色試劑來自于北京藍譜生物科技有限公司，其它分析純試劑購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取都使用QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒進行，DNA濃度由核酸測定儀（Nano Drop 3300）檢測得到。

1.2.2 引物設計 根據GenBank及相關文獻資料我們獲得了轉基因水稻Bt63轉化體特異性序列，再根據網上軟件工具Primer Explorer V4（http：// primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 設 計 選 擇LAMP引物。由于涉及到專利和知識產權保護，引物序列在本文中不公開。

1.2.3 LAMP擴增 LAMP 反應體系與反應條件：25 μL體系內反應各組分終濃度為：內引物FIP和BIP 各0.8 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，dNTPs 400 μmol/L，1× ThermoPol Reaction Buffer，加入模板DNA后，95℃加熱5 min后冰上冷卻，再加入 Bst DNA 聚合酶大片段8 U。LAMP 反應條件：將LAMP 反應體系迅速置于63℃溫度下反應1 h后，終止反應。如果進行熒光顯色反應，在反應前加放入顯色反應液，若是陽性擴增，在紫外光下則會發出熒光，若是陰性擴增，在紫外光下則不會發光。

2 結果

2.1 特異性驗證

分別用LAMP體系對不同的作物進行了反應，紫外檢測結果如圖2所示。在紫外光下，只有6號和P號的管子中有熒光產生，其余均為陰性。其中6號為轉基因水稻Bt63，P為陽性對照，而其它的轉基因作物和陰性對照都沒有擴增，說明LAMP的特異性很好，同時GenieⅡ的擴增結果也證明了這點（圖3）。

2.2 靈敏度試驗

為驗證LAMP檢測轉基因水稻Bt63方法的靈敏度，分別配制含有轉基因水稻Bt63 50%、10%、5%、1%、0.1%和0.01%的百分比濃度樣品，模板量為50 ng，擴增結果如圖4、圖5所示。0.01%濃度的轉基因檢測都有陽性信號出現，而0.001%濃度的轉基因檢測無陽性信號出現。3次重復檢測顯示，0.01%濃度的檢測結果基本穩定，因此認為本試驗中LAMP檢測轉基因水稻Bt63的靈敏度為0.01%。

3 討論

雖然目前檢測轉基因作物有多種方法，包括蛋白質類相關檢測技術［12，13］、化學物質指紋圖譜檢測技術以及核酸類檢測相關技術［14-17］，但是由于試劑成本與制備時間等原因，核酸類檢測技術應用更加廣泛。PCR 和熒光 PCR 法仍然是最常用以及最適用的檢測轉基因食品的方法［18-22］，國內眾多行業標準與國家標準均是以 PCR 或熒光定量 PCR 作為技術平臺。但是普通 PCR 法需要進行凝膠電泳，操作繁瑣且容易污染，而熒光定量 PCR 雖然檢測靈敏度高、重復性較好，但是該方法用到的儀器和試劑都很昂貴，難以適應日益普及和多元化發展的檢測需求。

本研究建立的環介導等溫核酸擴增法檢測轉基因水稻Bt63的方法，同PCR 技術相比具有較大優勢：（1）操作簡便，反應不需要復雜的儀器，只需一個維持恒定溫度的金屬加熱塊或者水浴鍋就能反應；（2）快速高效，檢測靈敏度高，整個擴增1 h 即可完成，如果在反應中加入環狀引物還可以促進擴增，減少反應時間；（3）特異性高，該技術由4 條引物擴增靶序列的6個區段，具有高度特異性，不易出現假陽性結果；（4）反應整個過程可以閉管操作，可以從源頭上控制氣溶膠污染。因此，LAMP技術檢測轉基因水稻Bt63的方法具有靈敏度高、特異性好，操作簡便、快速等特點，可以在進出口檢驗檢疫、食品安全監測等領域進行應用。

4 結論

采用環介導等溫擴增技術對轉基因水稻Bt63進行應用檢測。該方法特異性好，并且靈敏度達到0.01%（W/W），具有簡便、快速、準確等特點。

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（責任編輯 狄艷紅）

Specific Detection of Genetically Modified Rice Bt63 Using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Zhang Mingzhe1Chen Xi1Xu Junfeng2Chen Wujian1Wu Rong3Wu Zhiyi1
（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine，Hangzhou 310016；2. Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021；3. Hangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 310012）

It focused on the specific detection of genetically modified rice Bt63 using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）. The LAMP could effectively detect genetically modified rice Bt63 with high specificity and the sensitivity limit is 0.01%（W/W）. LAMP is a rapid and accurate method and would be applied to inspection, quarantine and food safety.

Loop-mediated isothermal amplification Genetically modified rice Bt63 Detection

2013-09-06

國家質檢總局科技計劃項目（2011IK249），浙江省科技廳公益性項目（2011C22065），浙江省科 技廳重大專項（2011C12023），浙江出入境檢驗檢疫局科研項目（ZK200958）

張明哲，男，高級農藝師，研究方向：分子生物學和植物檢疫；E-mail：mzzhang429@163.com