利用SSR標記鑒定熱研二號油綠苦瓜雜交種純度

劉子記 詹園鳳 楊衍

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，儋州 571737）

利用SSR標記鑒定熱研二號油綠苦瓜雜交種純度

劉子記 詹園鳳 楊衍

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，儋州 571737）

利用SSR分子標記技術對熱研二號油綠苦瓜進行雜交種純度檢測技術研究。研究結果表明，5對SSR標記在熱研二號親本間表現明顯的多態性，其中4對為共顯性標記，1對為顯性標記。為確保鑒定結果的準確性和可靠性，利用4對共顯性的SSR標記對熱研二號進行純度鑒定，雜交種純度為98.82%，與田間形態學鑒定結果完全一致。該研究表明利用SSR標記對熱研二號油綠苦瓜進行純度鑒定是切實可行的。

苦瓜 SSR 熱研二號 純度鑒定

苦瓜（Momordica charantiaL.，2n= 2x= 22）為葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（MomordicaL.）一年生草本植物，因果實具有特殊的苦味，故名苦瓜。苦瓜營養價值很高，富含維生素C、維生素E、氨基酸及礦物質。此外，苦瓜所含的藥理活性成分具有降血糖［1］、抗腫瘤［2］和降低膽固醇［3］等功效。海南省屬于華南地區北運瓜菜產業帶，對保障全國菜籃子工程建設具有不可替代性。苦瓜是海南主要冬種瓜菜種類之一，栽培面積逐年擴大。

作物雜交種純度顯著影響作物的產量和品質。開展種子純度檢測對保證種子質量和發揮優良品種的增產潛力具有重要意義。傳統田間形態鑒定所需時間較長，易受環境條件影響，不能完全滿足雜交種生產經營的需要［4］。DNA 分子標記技術的發展為作物品種鑒定與純度分析提供了更為準確、可靠、方便的方法。SSR標記具有快速、準確、多態性豐富、呈共顯性遺傳、操作簡單、結果穩定可靠等特點［5］，符合作物品種鑒別的4個基本準則：環境的穩定性、品種間變異的可識別性、最小的品種內變異和實驗結果的可靠性。可以快速、準確、有效地檢測生物體中的遺傳變異，被廣泛用于黃瓜［6，7］、甜瓜［8］、西瓜［9］等瓜類作物品種純度檢驗。與黃瓜、西瓜和甜瓜相比，苦瓜基因組研究進展比較緩慢，公開發表的基因組序列資源和SSR標記數目非常有限，目前國內外尚無利用SSR標記鑒定苦瓜雜交種純度的研究報道。本研究擬以熱研二號油綠苦瓜雜交種及其親本為材料，旨在利用SSR標記建立苦瓜雜交種純度鑒定技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

熱研二號屬油綠型雜交苦瓜品種，由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所選育而成，適合在華南地區的海南、廣東、廣西苦瓜主產區推廣種植。母本材料02-20-4-9由來自日本沖繩省的一個栽培品種經過連續8代自交選育出的強雌性系，表現豐產、中熟、強雌性、高抗白粉病。父本MC009是來自云南玉溪的一個優良自交系，該自交系抗病性強，早熟。將熱研二號、母本及父本材料播種于營養缽中，待植株長至5-6片真葉時利用改良的CTAB法［10］提取02-20-4-9、MC009和熱研二號單株葉片的基因組DNA，貯于-20℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 多態性標記篩選 利用已開發的苦瓜SSR標記［11，12］，以母本材料02-20-4-9和父本材料MC009基因組DNA為模板進行擴增，篩選多態性的SSR標記。

PCR反應體系為10 μL，其中包括10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/ L dNTPs，50 ng引物，0.6 UTaqDNA聚合酶和60-100 ng模板DNA。擴增程序為94℃預變性3 min；94℃變性40 s，50-60℃（根據具體引物的退火溫度而定）退火40 s，72℃延伸1.5 min，35個循環；72℃終延伸6 min。PCR產物保存于4℃。4 μL擴增產物與2 μL上樣緩沖液混合經12%非變性聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=39∶1）凝膠電泳，銀染顯色進行帶型統計。

1.2.2 熱研二號雜交種純度鑒定 利用在親本材料間表現多態性的SSR標記，以熱研二號油綠苦瓜單株DNA為模板進行擴增，根據特異譜帶的擴增結果檢測雜交種的純度。將取材后的苦瓜幼苗按照順序移栽到中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所蔬菜試驗基地，在結果期依據品種的果皮顏色及果實特征特性逐株進行鑒定，將SSR標記鑒定結果與田間形態鑒定結果進行比較分析。

2 結果

2.1 材料DNA提取

在研磨苦瓜葉片時添加少量PVP能有效去除糖類物質，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA純度和濃度，樣品檢測結果（圖1）表明，DNA呈現一條清晰整齊的主帶，無明顯降解現象，符合SSR標記分析對DNA模板質量的要求。

2.2 多態性標記篩選

以母本材料02-20-4-9和父本材料MC009為模板篩選26對苦瓜SSR引物，其中15對引物能擴增出清晰可辨的條帶，擴增效率為57.69%，5對引物在親本間能擴增出明顯的多態性（表1，圖2），多態性比率為19.23%，BSSR3、BSSR7、BSSR9和BSSR14為共顯性標記，擴增出的特異譜帶能夠將雜交種與母本自交種、父本自交種區分開來；BSSR16為偏父本型的顯性標記，雜交種擴增出的譜帶與父本材料一致；多態性片段大小150-480 bp（圖2）。

2.3 利用SSR標記對熱研二號雜交種純度進行鑒定

共顯性標記可以有效區分雜交種、母本自交種和父本自交種。本研究選用在親本材料間表現共顯性的標記BSSR3、BSSR7、BSSR9和BSSR14對170株熱研二號油綠苦瓜進行擴增，擴增結果（圖3）表明，168個熱研二號單株具有雙親特異譜帶，屬于真實的雜交種，15號和26號單株缺少父本特異帶，與母本擴增圖譜一致，說明15號和26號單株為母本自交株，這可能由于雄花摘除不徹底導致母本自交結實致使雜交種中混有少量母本自交種，4對SSR標記的鑒定結果一致，熱研二號雜交種純度為98.82%。從分子標記鑒定結果來看，母本自交是降低雜交種純度的主要原因。母本材料02-20-4-9來自日本沖繩省，表現強雌性，果實長圓錐形，淺綠色，父本材料MC009來自云南玉溪，條瘤粗直均勻，深綠色。

在田間鑒定中，通過觀察果皮顏色和性別類型鑒定熱研二號純度。15號和26號單株果皮顏色為淺綠色，表現為強雌性系，其余植株均具有熱研二號油綠苦瓜典型特征，植株生長旺盛，分枝性較強，果實長圓錐形，皮色深綠有光澤，瓜形美觀，田間鑒定結果表明15號和26號單株屬母本自交株，標記鑒定結果與田間鑒定結果完全一致。該研究結果表明SSR技術可用于熱研二號油綠苦瓜雜交種純度快速檢測。

3 討論

作物雜交種純度田間種植形態鑒定所需周期較長，耗費大量人力、物力和財力，易受栽培措施及環境因素影響，另外鑒定者的觀察經驗也制約著鑒定的準確性。理想的鑒定技術不但要準確可靠，還要簡單、快速和經濟，這是品種純度鑒定技術的發展趨勢［13］。DNA分子標記技術的出現，為作物品種純度鑒定提供了更為準確、可靠、方便的方法。近年來，AFLP、RAPD和SSR等分子標記技術被廣泛用于作物雜交種純度鑒定。張菊平等［14］和林琿等［15］利用RAPD分子標記分別對‘碧綠3號’和‘閩研2號’苦瓜雜交種進行純度鑒定，標記鑒定結果與田間鑒定結果完全一致，但RAPD標記的穩定性和重復性較差。SSR標記技術不僅具有RFLP技術的穩定性和共顯性的優點，而且操作簡單和重復性較好，能夠將真正的雜交種和自交株、混雜株區分開，是進行作物雜交種純度鑒定的首選標記類型，已在多種農作物雜交種純度鑒定中得到應用。高海娜等［16］和苗明軍等［17］成功利用SSR標記對甘藍雜交種‘秦甘50’和‘西園4號’進行純度鑒定。SSR分子標記鑒定與田間形態鑒定相比，準確性更高，速度更快，能大大提高檢測效率，具有相當高的理論和應用價值。由于苦瓜基因組研究相對滯后，基因組序列資源非常有限，目前國內外關于利用SSR標記鑒定苦瓜雜交種純度的研究報道甚少。本研究以苦瓜雜種一代熱研二號及其父、母本為材料，建立了利用SSR分子標記技術進行苦瓜雜交種純度鑒定的技術體系。通過對兩種純度鑒定結果比較分析發現，田間形態學鑒定與標記鑒定結果一致，熱研二號種子純度為98.82%。該結果說明本試驗建立的SSR技術體系可用于苦瓜雜交種純度的快速檢測。

單對標記不易區分因隔離不嚴產生的生物混雜，因此利用單對標記鑒定雜交種純度具有一定的局限性。為確保鑒定結果的準確性和可靠性，本研究選取4對共顯性的SSR標記對熱研二號的多個遺傳位點進行檢測，4對標記的檢測結果一致，雜交種中僅混雜了母本自交種，該研究結果表明母本自交是降低熱研二號油綠苦瓜雜交種純度的主要原因。

4 結論

建立了快速、穩定的檢測熱研二號油綠苦瓜雜交種純度的SSR分子標記技術體系，分子標記鑒定結果與田間形態學鑒定結果完全一致，為熱研二號油綠苦瓜良種的安全使用提供了科學依據。

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（責任編輯 李楠）

Hybrid Purity Identification of Reyan No. 2 Using SSR Markers

Liu Ziji Zhan Yuanfeng Yang Yan
（Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737）

The purity identification of Reyan No.2 was performed by using SSR marker technique. The results showed that 5 SSR markers were polymorphic between the parents of Reyan No.2, among which 4 were co-dominant markers, one was dominant marker. To ensure the accuracy and reliability, 4 co-dominant SSR markers were used for purity identification of Reyan No.2. The hybrid purity was 98.82%, which was completely consistent with field identification. It is feasible to conduct purity identification of Reyan No.2 using SSR markers.

Bitter gourd SSR Reyan No.2 Purity identification

2013-09-06

海南省自然科學基金項目（312025），中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金資助項目（1630032012007，1630032012002）

劉子記，男，博士，助理研究員，研究方向：蔬菜分子生物學及遺傳育種；E-mail：liuziji1982@gmail.com

楊衍，男，博士，副研究員，研究方向：瓜菜遺傳育種；E-mail：catasvegetable@gmail.com