根癌農桿菌介導的虎杖莖尖轉化研究

柳忠玉趙樹進

（1. 長江大學生命科學學院，荊州 434025；2. 廣州軍區廣州總醫院，廣州 510010）

根癌農桿菌介導的虎杖莖尖轉化研究

柳忠玉1趙樹進2

（1. 長江大學生命科學學院，荊州 434025；2. 廣州軍區廣州總醫院，廣州 510010）

為了建立根癌農桿菌介導的虎杖莖尖遺傳轉化體系，以虎杖的莖尖為轉化受體，研究了攜帶白藜蘆醇合酶基因（PcRS）的根癌農桿菌載體介導的虎杖遺傳轉化若干因素對轉化效果的影響。結果顯示，較適宜的轉化系統為預培養2 d，農桿菌菌液（OD600值為0.6）侵染10 min，共培養3 d，在含8 mg/L 潮霉素的培養基上誘導不定芽。利用該體系從 300 塊莖尖外植體中共轉化獲得 15株抗性再生植株，經 PCR 和 Southern 雜交檢測，有 6 株虎杖的基因組中已整合進了目的基因。

虎杖 莖尖 根癌農桿菌 遺傳轉化

虎杖（Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥。虎杖根中含有大量具有治療效用的次級代謝物，如白藜蘆醇、虎杖苷、蒽醌類等。其中白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗衰老、保護心血管系統等廣泛的生物學功能［1-3］。虎杖已取代葡萄，成為最重要的白藜蘆醇藥源植物。

盡管虎杖具有重要的藥用價值和經濟價值，但其分子遺傳和基因組的研究仍十分缺乏。最近，郝大程等［4］利用測序技術分析虎杖根轉錄組特性，識別出與白藜蘆醇、蒽醌及其糖苷生物合成有關的基因，并且發現大量序列代表轉座子（TEs）和單重復序列（SSRs），這些結果有望用于虎杖植株的遺傳改良。在白藜蘆醇的生物合成途徑中，白藜蘆醇合酶是一個關鍵限速酶，在植物中過量表達該基因可以提高白藜蘆醇含量或增強植物抗逆性［5］。建立快速高效的虎杖遺傳轉化體系顯得尤為迫切，但是當前關于虎杖遺傳轉化體系的研究仍未深入和系統。現有的研究表明，虎杖是含酚類物質較多的藥用植物，其愈傷組織誘導率低并且基部易褐化，不利于進一步的生長及分化［6］。利用發根農桿菌誘導虎杖毛狀根的產生，能提高毛狀根中活性成分含量，但存在陽性毛狀根生長緩慢，容易褐化等問題［7，8］。利用植物莖尖為轉化受體，不必經過誘導愈傷及分化成苗階段，轉化后可以直接成苗，莖尖轉化已成功用于單子葉或雙子葉植物，如小麥、棉花、玉米、太子參和高粱等［9-13］，而以虎杖莖尖為受體進行遺傳轉化的研究尚未見報道。

本研究以虎杖莖尖為轉化受體，研究不同因素對莖尖遺傳轉化的影響，以期為利用虎杖莖尖建立優良的轉化受體系統奠定重要的技術基礎和提供理論依據，并為今后虎杖基因的分子生物學研究和品種改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 虎杖植株由廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心提供。

1.1.2 載體和菌株 本研究所用植物過量表達載體pCAMBIA1380-35S-PcRS為筆者構建［14］，含有虎杖白藜蘆醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase）和潮霉素磷酸轉移酶基因。根癌農桿菌EHA105由華南農業大學植物基因組學與生物技術重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 培養基配方 誘導培養基：MS + 0.05 mg/L TDZ（Thidiazuron，苯基噻二唑基脲）+ 0.5 mg/L NAA（naphthlcetic acid，萘乙酸），pH5.8。共培養基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 40 mg/L AS（Acetosyringone，乙酰丁香酮），pH5.5。篩選培養基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg（hygromycin，潮霉素），pH5.8。增殖培養基：MS + 0.1 mg/L CPPU（N-（2-chloro-4-pyridyl）-N'-phenylurea，氯吡苯脲）+ 1.0 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg，pH5.8。根誘導培養基：MS +1.0 mg/L NAA + 0.5% 活性炭，pH5.8。

1.2.2 虎杖無菌苗的獲得與莖尖外植體制備 將虎杖嫩莖剪成長 5 cm左右的莖段，沖洗約1 h，移到超凈工作臺上，用 70%的乙醇消毒 30 s，1.5%次氯酸鈉振蕩洗滌 20 min，再用無菌水沖洗 4-5遍。然后切取帶腋芽的莖段 1 cm左右，接種到誘導培養基上誘導芽的生長。將誘導形成的叢生芽分離成單個芽，繼續培養成苗。取虎杖無菌試管苗放到解剖顯微鏡下，剝掉生長點附近包裹的葉片，當莖尖裸露出來后用接種針輕輕劃傷頂端分生組織，然后把附帶有莖尖的0.5 cm左右長的莖段切下來備用。

1.2.3 虎杖莖尖潮霉素敏感性試驗 在誘導培養基中添加潮霉素，將潮霉素的濃度設為0、2、4、8、15 和 30 mg/L 共 6 個水平，每個處理接入 100個虎杖莖尖外植體，試驗重復 3 次，培養 15 d，觀察外植體的色澤變化、生長狀態和存活情況。

1.2.4 轉化條件的選擇 分別在保持其他因素相同的條件下進行單因素試驗，評價各因素對農桿菌侵染虎杖莖尖的影響效果，以確定最佳的侵染條件。將處理好的虎杖莖尖在誘導培養基上預培養 1-8 d。將農桿菌懸浮液OD600值調整為 0.2-0.8，侵染經過預培養的莖尖受體5-25 min。侵染結束后用滅菌濾紙吸干多余菌液，置于墊有一張滅菌濾紙的共培養基上，黑暗中共培養 2-5 d。共培養結束后，轉移到篩選培養基上，將篩選獲得的抗性芽轉移到增殖培養基生長至 3-5 cm高，再轉至根誘導培養基使其長成完整植株。侵染后受體在光照培養箱中培養，光/暗為 16 h/8 h，溫度 22-25℃。所有試驗均為每個處理檢測 100 個莖尖，重復 3次。采用潮霉素抗性芽的分化率（%）和增殖系數作為評價轉化效果的指標，其計算方法如下：

分化率（%）= 再生抗性芽的莖尖數/ 接種莖尖數×100%

增殖系數= 莖尖再生抗性芽總數/ 再生抗性芽的莖尖數

1.2.5 轉基因虎杖的PCR檢測 用CTAB法提取轉基因虎杖和野生型虎杖的葉片基因組DNA。用潮霉素基因特異引物HPTf（5'-CGCCGATGGTTTCTACAA-3'）和HPTr（5'-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3'）進行PCR檢測。PCR擴增條件為：94℃ 預變性 2 min；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共28個循環；最后 72℃ 延伸 10 min。預期擴增片段大小為500 bp。

1.2.6 轉基因植株的Southern雜交 對PCR鑒定為陽性的轉化植株和野生植株，取 30 μg虎杖基因組DNA，經EcoR I 酶切DNA，以引物HPTf和HPTr擴增的潮霉素基因為探針模板，用地高辛隨機引物標記試劑盒進行標記。按照文獻［14］方法進行Southern雜交。

2 結果

2.1 虎杖莖尖對潮霉素的敏感性

本研究以潮霉素作為篩選標記，為有效篩選抗性苗，將制備的莖尖分別置于不同濃度梯度的潮霉素培養基上進行篩選，觀察外植體的色澤變化、生長狀態和存活情況，試驗結果見表1和圖1。從表1和圖1結果可以看出，對照組的虎杖莖尖生長迅速，并分化出綠色的芽，芽的存活率為 95.6 %；隨著潮霉素濃度的增高外植體生長減緩，分化出的芽弱小且存活率逐漸降低至 23.7%；高濃度潮霉素處理造成植物組織失綠褐化并迅速死亡。當潮霉素濃度在4 mg/L 以下不能有效抑制非轉化細胞的生長，容易造成大量非轉化體的逃逸；潮霉素濃度在 15 mg/L以上時，外植體迅速死亡將影響轉化細胞的正常生長；而潮霉素濃度 8 mg/L 處理既能有效抑制非轉化組織的生長，又不至于造成細胞迅速死亡，所以潮霉素濃度 8 mg/L是莖尖轉化外植體篩選的適宜濃度。

2.2 預培養時間對轉化的影響

將虎杖莖尖分別預培養 1、2、4 和 8 d，侵染菌液濃度OD600值約 0.4，侵染莖尖 10 min，共培養 3 d，統計轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數見表2。結果表明，適當的預培養可以提高莖尖的再生分化率。預培養 1 d 時的再生分化率較低（2.3%），再生芽生長細弱，不利于潮霉素抗性苗的獲得；預培養 2 d 的莖尖再生分化率最高（4.7 %），再生芽生長健壯；預培養 8 d 時的再生分化率反而下降（2.4 %）。所以選擇 2 d 作為預培養的時間。

2.3 菌液濃度對虎杖遺傳轉化的影響

將農桿菌的濃度OD600稀釋為 0.2、0.4、0.6 和0.8，侵染預培養 2 d 的莖尖 10 min，共培養 3 d，以轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數作為評價指標（表3）。本研究中不同的菌液侵染濃度對侵染效果的影響顯著。菌液侵染濃度OD600在 0.2 時分化率只有2.4 %，濃度為 0.6 時的分化率達 5.5 %，之后隨著濃度的增高分化率降低。故將農桿菌菌液濃度稀釋至 0.6 進行侵染。

2.4 侵染時間對虎杖遺傳轉化的影響

分別侵染預培養 2 d 的莖尖 5、10、15、20 和25 min，菌液濃度OD600約 0.6，共培養3 d，以轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數作為評價指標（表4）。經 10 min 侵染后的分化率與其他侵染處理都有顯著差異，侵染5、20 和25 min 之間的差異不顯著。侵染 10 min的再生分化率達5.3%，增殖系數較高且再生芽強壯，故將侵染時間選擇在10 min。

2.5 共培養時間對虎杖遺傳轉化的影響

用OD600值約 0.6 的菌液侵染預培養 2 d 的莖尖10 min，分別于黑暗中共培養 2、3、4 和 5 d，以轉化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數作為評價指標（表5）。不同共培養時間對侵染結果的影響差異較大，2 d時分化率較低（2.4 %），經3 d 共培養后分化率可達 5.6%，但是共培養 5 d 后的分化率又降到2.9 %。本試驗條件下選擇在侵染后共培養3 d 較為適宜，有利于獲得較多生長健壯的抗性再生芽。

2.6 虎杖轉化苗的獲得

虎杖莖尖遺傳轉化各階段如圖 2所示。剝離好的莖尖經預培養后（圖 2-A），進行農桿菌侵染，并共培養3 d（圖 2-B）；然后轉移到篩選培養基上篩選（圖 2-C），不具潮霉素抗性的莖尖逐漸褐化死亡；將經篩選后成活的莖尖轉移到增殖培養基上（圖2-D），促進芽增殖與伸長；待幼苗生長至 3-5 cm高，轉至根誘導培養基進行生根（圖 2-E）；最后移栽到盆土中生長（圖 2-F）。

2.7 轉基因虎杖的PCR檢測

按照上述遺傳轉化體系，剝取虎杖莖尖 300個，經農桿菌侵染轉化、篩選，獲得了移栽成活的抗性植株共 15株，潮霉素基因的PCR檢測（圖3）顯示其中 6株為轉基因的陽性植株，這些轉基因植株均含有預期的約 500 bp的DNA片段。

2.8 轉基因虎杖的Southern雜交

選取PCR鑒定為陽性的轉基因虎杖植株，提取葉片基因組DNA，經EcoR I酶切、電泳、轉膜后以潮霉素基因為雜交探針的Southern雜交結果（圖4）表明，在這 6個株系中均檢測到雜交條帶，而野生虎杖沒有雜交信號。因此，這些轉基因虎杖株系的基因組中確實整合了目的基因。

3 討論

本試驗前期采用葉盤法和愈傷組織侵染方法進行轉化遇到諸多困難：葉盤經過不同激素組合誘導，較難誘導產生不定芽；虎杖是含酚類物質較高的藥用植物，其愈傷組織易褐化、難分化成苗。而植物莖尖具有變異性小、有利于保持原有材料的優良性狀等特點，國內外很多學者利用莖尖或莖尖分生組織獲得了轉基因植株［9-13］。因此，本試驗選擇莖尖為轉化受體，探討了影響虎杖莖尖遺傳轉化的主要因素。

潮霉素的毒性機理是干擾植物細胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2 的結合，從而抑制肽鏈的延長。潮霉素濃度過低易造成假陽性率過高；潮霉素濃度過高，可能導致不能得到足量的轉基因植株。在對植物材料進行基因轉化之前，對受體材料進行潮霉素敏感性試驗是十分必要的。段曉昱等［15］的研究表明向日葵莖尖、子葉、胚軸不同部位轉化外植體對潮霉素敏感性存在一定的差異；大豆品種黑農 35的子葉節分化的潮霉素篩選濃度為 6 mg/L，而叢生芽生根的潮霉素篩選濃度降低為2 mg/L［16］；可見對于同一種植物，不同的外植體對抗生素的敏感性也是不同的。本研究通過虎杖莖尖對潮霉素的敏感性試驗，確定了虎杖莖尖轉化的適宜濃度為 8 mg/L。在連續篩選過程中一直使用同一濃度進行篩選，這可能是造成轉化率低的原因之一。在后續的研究中可以考察虎杖不同部位外植體對潮霉素的敏感性，采用梯度添加篩選劑的方式來提高轉化率。

在植物遺傳轉化中，預培養可以促進細胞分裂，處于分裂狀態的細胞更易整合外源DNA，從而提高轉化率；另一方面預培養能減少褐化現象的產生［17］。趙福永［18］對含酚類物質較高的棉花進行了預培養處理，根誘導階段根誘導率要比對照組高 15%左右。虎杖也是含酚類物質較高的植物，本試驗中預培養2 d 是最佳處理，而預培養時間超過 8 d，轉化率顯著下降。轉化率隨著預培養時間的延長先增加后下降，在高粱莖尖轉化中也有類似報道，其原因可能是預培養時間過短莖尖傷口未愈合易受農桿菌的侵害；預培養時間過長莖尖傷口細胞已不能提供足夠的誘導農桿菌貼壁的受體，或由于莖尖分生組織細胞的分裂速度減緩，進入細胞核的T-DNA 量減少［13］。王沛雅等［19］對河北楊的遺傳轉化研究表明，預培養2 d以上可以顯著提高轉化率，但預培養 2-8 d 間的差異不顯著，轉化率并不表現出隨著預培養時間的延長先增加后下降的趨勢，說明預培養的時間對轉化率的影響可能與所選用植物材料等有關系。

本試驗成功建立了虎杖莖尖為轉化受體、以潮霉素為篩選劑的根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系，但虎杖莖尖的轉化率遠低于棉花［20］、小麥［9］等作物的莖尖轉化效率，所以該遺傳轉化體系還有待優化。后續工作可以從農桿菌菌株、農桿菌介導法結合漩渦振蕩、真空負壓處理等方面來進一步優化該轉化體系。

本試驗希望通過提高關鍵酶基因PcRS在虎杖中的表達水平，調控虎杖中白藜蘆醇的生物合成。PCR和Southern雜交檢測，表明外源基因已經整合到轉基因植株的基因組中。但是本試驗只進行EcoRI 酶的單酶切，還不能準確確認外源基因插入的拷貝數和位點。在后續Southern雜交試驗中可以采用多個限制性內切酶進行單酶切，或者采用雙酶切。另外轉基因植株的遺傳穩定性、外源基因的表達、活性成分的含量變化等方面還需要進一步深入研究。

4 結論

采用根癌農桿菌EHA105 菌株侵染虎杖莖尖較適宜的轉化系統為：預培養 2 d，農桿菌菌液濃度OD600為0.6，侵染10 min，共培養 3 d，在篩選培養基中添加 8 mg/L潮霉素，待篩選獲得的抗性芽生長至 3-5 cm高，再轉至根誘導培養基使其長成完整植株。利用該體系成功實現虎杖莖尖遺傳轉化白藜蘆醇合酶基因，本研究結果為拓寬虎杖遺傳轉化受體提供了技術和方法。

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（責任編輯 狄艷紅）

Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Shoot Tip of Polygonum cuspidatum

Liu Zhongyu1Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010）

In order to establish Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation system of Polygonum cuspidatum shoot tip, some key factors that affect transformation frequency of P. cuspidatum shoot tip were studied. The shoot tips of P. cuspidatum was infected by Agrobacterium tumefaciens EHA105 with the plasmid which contains PcRS gene. The superior transformation system was as following, precultured 2 days and then infected 10 minutes in suspension（OD600=0.6）, co-cultured 3 days, transgenic tissues and shoots were selected with 8 mg/L hygromycin. Six transgenic plants from 300 explants were obtained and the intergration of transgene was confirmed by PCR and Southern blot analysis.

Polygonum cuspidatum Shoot tip Agrobacterium tumefaciens Genetic transformation

2013-08-19

廣東省自然科學基金（10151001002000012），長江大學博士啟動基金項目（801100010122）

柳忠玉，女，博士，講師，研究方向：中藥生物技術；E-mail：zyliu2004@126.com

趙樹進，教授，博士生導師，研究方向：生物制藥；E-mail：gzzsjzhs@163.com