噬菌體展示抗克倫特羅抗體文庫的構建及單克隆抗體的篩選

董金華唐玉海喬寧韓金宏董美華董益陽

（1. 濰坊科技學院生物工程研發中心，山東 262700；2.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029）

噬菌體展示抗克倫特羅抗體文庫的構建及單克隆抗體的篩選

董金華1唐玉海1喬寧1韓金宏1董美華1董益陽2

（1. 濰坊科技學院生物工程研發中心，山東 262700；2.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029）

利用小白鼠免疫和噬菌體展示技術構建了噬菌體展示抗體文庫，從文庫中篩選獲得了一株抗克倫特羅單克隆抗體。該抗體的氨基酸序列尚未在世界基因數據庫中登錄，是一個新的抗體。該抗體對于游離克倫特羅的半抑制率IC50為0.602 μg/mL。該噬菌體展示的抗體片段可以用于競爭法檢測克倫特羅的含量，其能夠檢測出的最低濃度為15.6 ng/mL，具有較大的實用價值。

克倫特羅 抗體 噬菌體展示 免疫檢測

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLEN）是一種β2受體激動劑，屬于擬腎上腺素類藥物，分子量為313.7［1］。20世紀80年代初，美國的一家公司發現鹽酸克倫特羅可以明顯地促進動物的生長，并能有效地增加瘦肉率［2］，它能夠改變動物體內的代謝途徑，促進肌肉特別是骨骼肌中蛋白質的合成，抑制脂肪的合成，從而加快家畜生長速度，相對增加瘦肉比例。這一新發現很快被一些國家用于養殖業。飼料中添加了鹽酸克倫特羅后，可使豬牛羊等畜禽生長速度、飼料轉化率及胴體瘦肉率提高10%以上，所以鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑一度被廣泛使用。

但是后來科學家們發現人類過度攝入克倫特羅會引起巨大的不良反應，嚴重的可能會發生急性中毒，甲狀腺功能亢進，心律失調等癥狀［3］。20世紀80年代末期開始，在世界各地發生了多起克倫特羅中毒事件，我國在近幾年也時有發生。1997年中國香港17位居民因食用含有克倫特羅的豬內臟而中毒；1998年中國大陸首次發生的“瘦肉精”中毒事件，2001年在浙江省桐廬縣因食用被克倫特羅污染的豬肉及豬內臟而導致180余人中毒，廣東省河源市發生特大瘦肉精中毒事件，共484人中毒；2006年上海連續發生“瘦肉精”食物中毒事故，300多人中毒；2011年3月15日，央視“3·15”特別節目《“健美豬”真相》再一次將瘦肉精推到風口浪尖。另外，近幾年有些運動員也因誤食被克倫特羅污染的豬肉而被檢出體內有興奮劑而受到影響。2004年3月，國家食品藥品監督管理局、公安部、農業部、商務部、衛生部等八個部局聯合發布文件，阻止違禁添加劑留下養殖行業，加強對瘦肉精的防堵。但此后依然有生產商非法制造、銷售及使用該化學藥品。目前對該藥品的檢測多使用液相色譜或者氣相色譜，而上述方法均需要昂貴的設備及儀器，很難普及應用。

利用抗體測定抗原的方法叫免疫測定法（Immunoassay），該方法不需要大型且昂貴的設備，相對來說實施容易，測定成本低，近幾年來得到了很大的發展?？贵w技術經歷了多克隆抗血清及單克隆抗體的開發，現在已經發展到了基因工程抗體階段。 抗體的抗原結合片段（Fragment，antigen binding，Fab）及單鏈抗體（Single chain variable region，ScFv）作為基因工程抗體的代表，具有與全長抗體同等的抗原結合功能，可以取代全長抗體用于免疫學測定［4］。 抗體Fab片段包含有抗體的輕鏈（Light chain）和重鏈的可變領域（Variable region，VH）及一個恒定領域（Constant region 1，CH1），在保持有抗體原有的抗原結合功能的同時，又具有很強的穩定性。Fab片段的分子量只有抗體分子量的1/3，因此在用于醫藥時同ScFv片段相似，具有組織傳透能力強，免疫原性低等優點［5］。噬菌體抗體展示技術最早是在20世紀90年代初由Winter等開發成功［6］。該技術的核心是通過將抗體的表型和基因型相聯系，從構建的抗體庫中篩選抗體的同時可以獲得編碼該抗體的基因，為目前抗體開發中最常用的技術之一。

本研究使用牛血清蛋白與克倫特羅的偶聯物（BSA-CLEN）對小白鼠進行免疫，利用噬菌體展示技術構建噬菌體展示抗體文庫，并通過對該偶聯物進行淘篩獲得一株能夠與克倫特羅特異結合的抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

克倫特羅與牛血清蛋白的偶聯物（BSA-CLEN）系購自杭州南開日新生物技術有限公司；游離鹽酸克倫特羅購自中國藥品生物制品檢定所；總RNA 提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；大腸桿菌DH5α購自TaKaRa 生物技術有限公司；大腸桿菌TG-1購自Amersham Bioscience（日本東京）；克隆基因用的限制性內切酶、聚合酶等均購自TaKaRa生物公司；其他試劑均為國產分析純。

載體pIT2 源自英國MRC。輔助噬菌體M13-KO7購自New England Biolabs（MA，USA）。

擴增抗體用的引物是根據GenBank數據庫中鼠源抗體重鏈及輕鏈可變領域基因序列及其他文獻中的序列設計并由Invitrogen Inc.（日本東京）合成。所用引物的序列見表1。

1.2 方法

免疫小白鼠后提取脾臟細胞的總RNA，并以其為模板擴增抗體的基因，用限制性內切酶處理后的抗體基因克隆至噬菌體展示載體，轉染感受態大腸桿菌，制作抗體展示文庫。固定抗原后對該抗體文庫進行淘篩，最后獲得具有克倫特羅特異性的單克隆抗體（圖1）。

1.2.1 動物試驗 兩只BALB/c小白鼠用于BSA-CLEN免疫。免疫隔周進行4次，每次用量為100 μg。完全弗氏佐劑用于增加免疫效果。最后一次免疫1周后，從小白鼠的尾部取血確認免疫效果。免疫成功后，提取小白鼠脾臟細胞，用于提取總RNA。

1.2.2 脾細胞總RNA的提取 按照試劑盒的說明，運用Trizol法提取總RNA，并對之進行甲醛變性瓊脂糖電泳分析。同時通過紫外分光光度法測定總RNA的純度。

1.2.3 擴增抗體可變區域的基因 抗體可變區域的基因是利用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2進行擴增。根據試劑盒說明書，首先利用PrimeScript?RTase以RNA為模板合成cDNA，然后直接在反應系中利用TaKaRa Ex Taq?HS完成抗體基因的VH和VL擴增。擴增條件為94℃預變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環后72℃延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，并使用膠回收試劑盒回收擴增產物。

1.2.4 構建抗體文庫載體 使用限制性內切酶SalI和NotI將回收的抗體可變領域基因VL消化并純化后，將其與用同樣酶處理的pIT2載體［7］連接，連接反應使用TOYOBO的Ligation High Ver.2進行30 min，然后將連接產物轉化進大腸桿菌DH5α感受態細胞，稀釋培養菌液滴定VL文庫庫容的大小，培養剩余大腸桿菌過夜提取質粒。將載體進行SfiI和XhoI雙酶切處理后回收純化目的片段，并使之與同樣雙酶切處理的VH基因連接，轉化入大腸桿菌TG-1，滴定抗體文庫的大小，隨機挑斑進行培養并對抗體文庫進行鑒定。培養剩余菌液用于制作噬菌體展示抗體文庫。

1.2.5 制作抗體展示文庫 使用2YTA液態培養基（含有100 μg/mL的Amp的2YT培養基） 培養轉化后的大腸桿菌TG-1至OD600約為0.6，以MOI=20的比例加入輔助噬菌體M13-KO7（New England Biolabs，MA，USA），保持菌液在37℃ 30 min，然后以3 000×g的速度離心10 min，去上清后加入50 mL的2YTAK（含有100 μg/mL的Amp和50 μg/mL Kan的2YT培養基），懸浮菌體，30℃振蕩培養過夜。

1.2.6 噬菌體展示抗體文庫的回收 以1 000×g的速度離心培養菌30 min后，量取上清并加入1/4體積的PEG/NaCl溶液（20%聚乙二醇6000，2.5 mol/L NaCl），于4℃保持60 min，然后4℃，1 000×g的速度離心，完全棄上清后加入適量的高壓滅菌的PBS溶液（KH2PO41.47 mmol/L；Na2HPO48.10 mmol/L；NaCl 136.89 mmol/L；KCl 2.68 mmol/L）將沉淀溶解，制得噬菌體展示抗體文庫。滴定該抗體庫的滴度，并用于抗體的篩選。

1.2.7 抗體的篩選 將100 μL的BSA-CLEN（10 μg/mL）分別加入到3個微孔中，4℃過夜；第2天倒掉溶液并加入MPBS（含有2%脫脂牛奶的PBS溶液）在室溫下保持2 h封閉微孔；將1.2.6中回收的噬菌體溶液以MPBS稀釋至109CFU/100 mL（CFU：Colony Form Unit）的濃度并在每個微孔中加100 μL，室溫保持1 h；用PBST（含有0.1%TWEEN20的PBS溶液）在洗板機（BIO-RAD，1575）上洗板10次后用甘氨酸-HCl（pH2.7）將固定在微孔板上的噬菌體溶出；溶出的噬菌體用于感染大腸桿菌并制作第二輪淘篩用抗體文庫。重復以上操作3次，濃縮抗體文庫中的抗原特異抗體，并用ELISA法來鑒定抗原特異性抗體的濃縮效果。

1.2.8 單克隆抗體的篩選 在96孔培養用孔板內加入200 μL的2YTA培養基，挑取96個克隆并在37℃培養至OD600約為0.6，用輔助噬菌體感染菌體如1.2.6所述制作噬菌體；同時在96孔的微孔板內4℃過夜加入100 μL的BSA-CLEN（1 μg/mL），封閉后每個孔內加入100 μL的噬菌體溶液（80 μL的MPBS中加入20 μL的噬菌體溶液）并在室溫下保持1 h；使用洗板機洗板3次后加入抗噬菌體抗體Anti-M13 antibody/HRP（GE health，MA，USA）；再 次在室溫下保持1 h，洗板后加入底物TMBZ溶液（Sigma；100 μg/mL TMBZ和0.04 μL/mL H2O2in 100 mmol/L NaOAc，pH6.0）；室溫保持5 min后加入10%的H2SO4終止反應，測定樣品在450 nm波長下的吸光度。

1.2.9 單克隆抗體的分析 挑選8個陽性克隆A2、A3、B1、D1、E1、G12、H5及H6培養后委托上海生物工程有限公司對其序列進行了分析。重鏈和輕鏈序列解析用的引物分別為M13RV：5-GGAAACAGCTATGACCATG-3和pVLBack：5-CACTGGCTGGTTTCGCTAC-3?？贵w序列的分析使用了GENYTYX 軟件（GENETYX CORPORATION，日本東京），抗體可變領域的互補決定區（Complementarity-Determining Region，CDR）［8］的分析使用了NCBI IgBLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）。

1.2.10 競爭法測定溶液中克倫特羅的濃度［9］利用噬菌體展示的A2克隆測定了溶液中克倫特羅的濃度。即在96孔的微孔板上固定BSA-CLEN（1 μg/mL）后進行封閉，然后將噬菌體-抗體溶液和系列稀釋的游離克倫特羅溶液（濃度為0、0.016、0.08、0.4、2和10 μg/mL）混合后加入到微孔中，每個濃度設置3個重復；室溫下保持1 h后，用洗板機洗板，然后加入HRP修飾的抗噬菌體抗體，繼續在室溫下保持1 h，清洗微孔板后添加底物TMBZ顯色，測定在波長450 nm下吸光度，繪制標準曲線。

2 結果

2.1 抗體基因的擴增

抗體重鏈及輕鏈可變區域的基因VH及VL得以成功擴增，如圖2所示，VL基因的大小約為350 bp，VH基因稍大。雖然在目的條帶的上方有兩條非特異DNA也被擴增，但通過電泳后切出目的條帶，不會對基因的克隆造成影響。

2.2 噬菌體展示抗體文庫的構建

噬菌體展示抗體文庫分兩步構建，因為在抗體與抗原結合時，抗體的重鏈的作用大于輕鏈，所以為保證抗體文庫庫容中重鏈的多樣性，首先將SalI和NotI雙酶切處理的VL基因連接至目標載體，得到1個4.3×106的輕鏈文庫。然后將用SfiI-XhoI處理的抗體重鏈基因連接到含有輕鏈抗體基因的載體內，轉化大腸桿菌，完成了抗體文庫的構建。經過滴定確定構建的抗體文庫的庫容為5.6×106CFU。

2.3 克倫特羅抗體的濃縮

通過噬菌體ELISA對特異抗體的濃縮效果做了鑒定。如圖3所示，原始文庫R0及淘篩過程中的3個子文庫R1，R2，R3都不能跟BSA結合，而對于BSA-CLEN，雖然R0，R1噬菌體未與其結合，但使用了R2和R3噬菌體試驗樣的信號顯著增加，其中R2的信號強度高于R3。這表明在R2和R3子抗體文庫中能夠跟BSA-CLEN特異結合的抗體明顯增多，顯示針對BSA-CLEN的淘篩獲得成功。

2.4 單克隆抗體的篩選

制作了96種展示不同抗體克隆的噬菌體，并通過ELISA法對這96種噬菌體的抗原結合特性作了評價。結果如圖4所示，數十個克隆顯示了對BSACLEN的特異性。其中挑選8個陽性克隆A2、A3、B1、D1、E1、G12、H5及H6，對其序列進行了分析。2.5 抗體的序列

通過對挑選的8株抗體的序列分析發現，這8株抗體的基因序列完全相同，系同一個克隆。圖5顯示A2抗體的基因及氨基酸的序列?？贵w重鏈的可變領域分為V片段，D片段及J片段，而輕鏈為V片段和J片段。每個片段的基因又由幾個到幾十個不同序列的基因組成，這些基因的自由組合構成了具有一個V-D-J編碼的重鏈和一個V-J編碼的輕鏈。 其自由組合在抗原刺激B細胞而形成漿細胞后完成，從而在V（D）J編碼下分泌含有不同氨基酸的序列，產生多種多樣的免疫應答。A2抗體重鏈的V片段與鼠源抗體IGHV3-21*04的相同性最大，為85.1%，D/J片段則與IGHD3-16*02及IGHJ4*02有100%的相同性。該抗體的輕鏈V片段與鼠源抗體輕鏈IGVKV-11*01相同性最大，為70.5%，其J片段為IGKJ4*02。在抗體數據庫中沒有檢索到與A2抗體具有完全相同氨基酸序列的單克隆抗體，因此該抗體是一個新型抗體。

抗體可變區中的互補決定區CDR是與抗原表位直接結合的部位，決定該抗體的抗原特異性。圖5方框內的序列為抗體可變區的6個互補決定區。

2.6 應用A2抗體測定溶液中克倫特羅的含量

利用噬菌體展示的抗體（Phage-A2Fab），競爭法（Competitive ELISA）測定溶液中克倫特羅的含量。結果如圖6及表2所示，當溶液中游離的克倫特羅含量低時，溶液中的Phage-A2Fab跟固定在微孔板上的BSA-CLEN結合，洗板后在微孔中加入HRP修飾的抗噬菌體抗體，該抗體跟固定在微孔板表面的Phage-A2Fab結合，洗板后加入底物顯色。因結合的Phage-A2Fab多，其最終的信號強度也大。而隨著溶液中游離克倫特羅濃度的上升，溶液中部分Phage-A2Fab與游離的克倫特羅結合，因此跟微孔板上固定的BSA-CLEN結合的抗體便減少，信號的強度也逐漸降低。通過繪制標準曲線，求得該曲線的半抑制率（IC50）為0.602 μg/mL。同時以未添加抗原的樣品的吸光度減去3倍標準偏差計算得出該測定法能夠檢測出克倫特羅的最低量（Limit of detection；LOD）為15.6 ng/mL。

3 討論

抗體開發有著較長的歷史，其中20世紀70年代開發的雜交瘤技術為制作單克隆抗體開創了先河［10］。而在其后由Winter等開發噬菌體展示技術則實現在了抗體的表型和基因型的連接，即在獲得抗體的同時也能夠得到抗體的基因，為開發抗體的分子藥物奠定了基礎。 抗原結合片段Fab與單鏈可變領域抗體片段（ScFv）因為具有分子小，組織穿透性好，在血液中的半衰期短等特點，相對于全長抗體具有很大的優勢。

本研究通過用克倫特羅與BSA的偶聯物免疫小白鼠及制作噬菌體展示抗體文庫的方法克隆了一株抗克倫特羅的單克隆抗體A2。因為在現有的抗體數據庫中沒有檢索到與A2具有相同序列的抗體，所以這是一個新的抗體。通過對A2抗體基因的分析發現，該抗體重鏈可變領域的CDR2部分由17個氨基酸組成，遠遠長于只有5-9個氨基酸組成的其他的CDR，這符合小分子及半抗原鼠源抗體的特點［11，12］。

利用免疫動物的抗體基因構建抗體文庫，因為經過了免疫系統的選擇壓力，抗體文庫中針對免疫抗原的特異性豐度高于其他非特異性抗體，其中一部分抗體經過了免疫系統的親和力成熟過程，因此從這次構建的抗體中篩選到了具有高親和力和特異性的抗體。一般而言，噬菌體展示抗體文庫的庫容與所篩選到的抗體的親和力成正比關系，即庫容越大，能夠篩選到的抗體的親和力就越大［13］。 盡管該抗體能夠跟克倫特羅特異性結合并能應用于競爭法檢測溶液中克倫特羅的含量，但因為受抗體文庫庫容的限制，其親和性依然有較大的開發余地。噬菌體展示法的另外一個優勢是可以通過制作合成抗體庫完成抗體的試管內進化。今后我們將以該抗體為框架，并將其CDR的一部分隨機變異，制作合成抗體文庫并進行淘篩，開發具有更高親和性的抗體。

在本研究中，將A2抗體應用于競爭法測定游離克倫特羅的濃度，其LOD為15.6 ng/mL。隨著科學技術的進步，科學家們已經開發出了如Quenchbody Technology［14］，MusTag Technology［15］，及Phage-Immuno PCR［16］等測定迅速且靈敏度高的免疫測定方法。若將本研究中開發的A2抗體應用于以上科研成果，可開發出靈敏度更高，操作更加簡單的克倫特羅檢測技術。

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（責任編輯 李楠）

Construction of a Phage-displayed Anti-clenbuterol Antibody Library and Selection of Monoclonal Antibody

Dong Jinhua1Tang Yuhai1Qiao Ning1Han Jinhong1Dong Meihua1Dong Yiyang2
（1. Department of Research and Development，Weifang University of Science and Technology，Shandong262700；2. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing100029）

An anti-clenbuterol antibody was developed by immunization of mouse and construction of a phage displaying antibody library. The antibody has a novel sequence and the utilization of gene segments in germline was also identified. With this antibody, a competitive assay was performed and gave a limit of detection of 15.6 ng/mL. The IC50of phage-antibody with free clenbuterol against immobilized bovine serum albumin conjugated clenbuterol was 0.602 μg/mL. All the results suggested that the antibody is useful in practical applications.

Clenbuterol Monoclonal antibody Phage display Detection

2013-08-12

濰坊科技學院校級課題（博士基金）（W13K007）

董金華，男，副教授，研究方向：生物學；E-mail：newbio2010@gmail.com