黃秀芳+原向偉

[摘要] 目的 探討Sox9和Ⅱ型膠原蛋白（Col2al）在人類腰椎間盤退變中的表達及意義。 方法 應用免疫組織化學在退變和正常腰椎間盤組織中分別檢測Sox9和Ⅱ型膠原蛋白的表達，并分析其相關性。 結果 實驗組Sox9染色陽性率為20.0%（6/30），對照組Sox9染色陽性率為76.7%（23/30），兩組間染色陽性率有顯著性差異（P<0.05）。實驗組Col2al染色陽性率為33.3% （10/30），對照組Col2al染色陽性率為83.3% （25/30），兩組間染色陽性率有顯著性差異（P<0.05）。退變腰椎間盤中6例Sox9陽性者中，僅1例Col2al表達陰性，而在10例Col2al表達陽性者中，5例Sox9表達陰性，二者同時陽性5例，同時陰性表達19例。退變椎間盤中Sox9和Col2al的表達呈顯著正相關（P<0.05）。 結論Sox9和Ⅱ型膠原蛋白表達降低與腰椎間盤退變有關， Sox9可能通過下調Col2al的表達，共同參與腰椎間盤退變。

[關鍵詞] Sox9；Ⅱ型膠原蛋白；腰椎間盤退變；免疫組織化學

[中圖分類號] R363.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）03-18-04

隨著老齡化社會在中國的到來，頸、腰椎椎間盤退變所致頸肩痛、腰腿痛的發病率已逐漸增高，并且每年均要耗費相當的人力財力進行治療。其治療手段主要包括保守治療和手術治療，然而無論是脫水、鎮痛、理療等保守治療還是各種微創或開放手術方法均不能從根本上阻止椎間盤退變的發生和發展，并且手術治療還可能破壞脊柱運動的生理完整性，具有易復發、胃腸道反應等風險和并發癥[1]。因此在已有研究基礎上，針對椎間盤退變的靶點基因，通過基因治療的方法來阻止或改變椎間盤退變，以成為頸腰椎疾病基礎研究的熱點課題之一。

Sox9（SRY related high mobility group box gene 9）基因最早是作為早期胚胎發育相關基因而被發現，但在之后的研究中逐漸被發現具有調控軟骨細胞發育、成熟的重要功能[2-3]。比如在關節炎患者中致炎因子通過抑制Sox9的軟骨調控作用，減弱病變軟骨的再生和修復，從而引起關節炎遷延不愈[4]。而同樣以軟骨樣細胞為主的椎間盤組織中Sox9基因的表達情況如何呢？我們采用免疫組織化學研究腰椎間盤退變臨床標本中Sox9及其下游Col2al（Ⅱ型膠原蛋白）的表達情況，并探討其機制，以期為分子水平預防和治療人類椎間盤退變性疾病提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2010年1月～2012年12月于我院住院因腰椎間盤突出癥、腰椎滑脫、腰椎管狹窄等入院后路手術所取得的腰椎間盤患者30例作為實驗組，患者年齡均>50歲，其中男16例，女14例，標本均經病理證實為退變椎間盤。選取腰椎外傷后路手術取出腰椎間盤標本30例作為對照組，患者年齡16～30歲，標本均經病理證實為正常椎間盤，其中男18例，女12例。

1.2 主要試劑

Sox9兔多克隆抗體、Col2al鼠抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，即用型超敏S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色液為福州邁新生物工程有限公司產品。多聚賴氨酸購自sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本制備 標本均經4%多聚甲醛固定6～8h。常規脫水，石蠟包埋，4μm切片，采用HE染色和免疫組化染色。

1.3.2 免疫組織化學染色 采用S-P免疫組織化學染色超敏試劑盒，按期說明書進行實驗。石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗5min×2次，蒸餾水新鮮配制3%過氧化氫液，滅活內源性過氧化物酶，PBS洗3min×3次。將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱沸騰，5～10min后，反復1～2次；PBS洗3min×3次，封閉血清37℃孵育10min；滴加一抗，4℃孵育12h，PBS洗3min×3次；滴加生物素標記的二抗，37℃孵育10min，PBS洗3min×3次；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃孵育10min，PBS洗3min×3次；滴加DAB顯色劑，鏡下確定反應時間終止。顯色完成后，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；顯微鏡下觀察染色結果。

1.3.3 染色結果的判斷標準 Sox9位于胞核，Col2al位于胞漿，陽性細胞染色呈棕黃色，隨機計數10個視野，陰性（-）判定為無陽性細胞或陽性細胞比例<10%，弱陽性（+）判定為陽性細胞比例10%～30%，中度陽性（++）判定為陽性細胞比例30%～60%，強陽性（+++）判定為陽性細胞數>60%。

1.4 統計學方法

采用SPSS15.0軟件進行統計，兩樣本率的差別檢驗采用x2檢驗，相關性檢驗采用2×2列聯表關聯性分析，以α=0.05作為檢驗標準。

2 結果

2.1 退變腰椎間盤中Sox9的表達

陽性細胞胞核呈棕黃色（圖1A）。實驗組Sox9染色陽性率為20.0%（6/30），其中陰性（-）24例，弱陽性（+）2例，中度陽性（++）3例，強陽性（+++）1例。對照組Sox9染色陽性率為76.7%（23/30），其中陰性（-）7例，弱陽性（+）6例，中度陽性（++）10例，強陽性（+++）7例。兩組間染色陽性率差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 退變腰椎間盤中Col2a1的表達

陽性細胞胞漿呈棕黃色（圖1B）。實驗組Col2al染色陽性率為33.3%（10/30），其中陰性（-）20例，弱陽性（+）5例，中度陽性（++）3例，強陽性（+++）2例。對照組Col2al染色陽性率為83.3%（25/30），其中陰性（-）5例，弱陽性（+）2例，中度陽性（++）10例，強陽性（+++）13例。兩組間染色陽性率有顯著性差異（P<0.05）。見表2。endprint

2.3 退變腰椎間盤中Sox9表達和Col2al表達的關系

退變腰椎間盤中6例Sox9陽性者中，僅1例Col2al表達陰性，而在10例Col2al表達陽性者中，5例Sox9表達陰性，二者同時陽性5例，同時陰性表達19例。退變椎間盤中Sox9和Col2al的表達呈顯著正相關（P<0.05）。見表3。

3 討論

隨著我國老齡化社會的到來，由椎間盤退變造成的頸、腰椎疾病發病率逐漸增高，并嚴重影響患者生活質量。研究發現，椎間盤退變是一系列脊柱退行性疾病的根本病理基礎，其不僅表現為組織形態學的變化，而且表現為椎間盤基質生化組成與性質的系統性改變，并可直接導致椎間盤生物力學功能的減退和喪失，誘發脊柱不穩定的發生，其結局往往是椎管狹窄、脊柱節段不穩、骨贅形成、椎間盤突出及隨之而來的神經根、脊髓受壓等[5]，在中老年患者中，手術治療存在風險和復發、神經功能損害等并發癥。

目前來看，椎間盤退變的分子機理仍不完全清楚，但椎間盤組織中部分軟骨調控相關基因表達異常導致的功能障礙與其相關[6]。Sox9基因最早是作為早期胚胎發育相關基因而被發現[7-8]，此外，Sox9發生基因突變（包括點突變、短尾突變等），將導致短指畸形，原因為正常的軟骨形成過程被擾亂[9]。而在骨性關節炎患者，患處炎性因子表達明顯增強，從而抑制Sox9基因的軟骨生成作用，進一步減弱了病變軟骨的再生和修復，成為炎癥遷延不愈的重要原因[10]。表明Sox9基因也是調控軟骨形成和功能的重要基因。本研究也發現在退變的人腰椎間盤組織中，Sox9的表達相對于正常椎間盤存在明顯下調，同樣的現象也在頸椎間盤退變標本中發生[11]，表明在Sox9的異常表達與人類椎間盤退變的確存在重要聯系。但Sox9的表達下調究竟隨著年齡是線性還是跳躍性進展仍不清楚，我們傾向認為線性進展。30～50歲之間的腰椎間盤突出發病率并不高，我們并未將之納入研究，對此部分患者的研究可能回答上述問題，這是我們下一步工作的設想。

椎間盤的主要成分是水、膠原和蛋白多糖，正常情況下纖維環中含有60%Ⅱ型膠原和40%Ⅰ型膠原，因此膠原的退化和減少也是椎間盤退變的主要組成部分。軟骨基質Ⅱ型膠原蛋白由Col2a1基因編碼[12]，我們發現退變的人腰椎間盤組織中，Col2a1的表達相對于正常椎間盤也存在明顯下調，Col2a1的低表達導致Ⅱ型膠原蛋白合成減少，軟骨退化，修復降低，最終引起椎間盤退變。對于Col2a1和Sox9之間的關系，我們發現二者存在明顯的正向相關，提示二者可能處于同一信號通路。事實上Sox9可通過轉位入細胞核，直接結合Col2a1的增強子、或與其他蛋白形成轉錄復合體結合Cola1的啟動子E-box等多種方式，調控其表達[13-15]。這些研究均表明Col2a1是Sox9的下游靶基因，轉錄因子Sox9基因可正向調控軟骨細胞中Col2a1的表達，通過促進Ⅱ型膠原蛋白的表達而促進軟骨的發育和成熟，而當退變發生Sox9基因表達降低時會下調Col2a1的表達而致Ⅱ型膠原蛋白合成減少，最終進一步加重椎間盤退變。

目前隨著分子生物學等學科的迅速發展，基因治療逐漸成為一種切實可行的治療手段。有學者通過腺病毒介導的瞬時轉染將重組BMP2（人骨形態發生蛋白2）導入兔椎間盤退變細胞，可引起Sox9的高表達，進一步增加Col2al的表達，從而增強Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達合成[16-17]。而腺相關病毒介導的Sox9過表達可改善關節軟骨的修復[18]，所以Sox9是一個逆轉椎間盤退變的潛在基因治療靶點。我們期望通過本項目的工作，能為治療椎間盤退變提供了一條新的思路。

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